基于超分支滚环扩增的核酸试纸条检测食品致病菌的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于超分支滚环扩增的的胶体金核酸试纸条检测食品致病菌的方法及检测单增李斯特菌和沙门氏菌的试剂盒，属于生物检测技术领域。该方法主要的步骤包括：（1）食品致病菌DNA的提取及酶切，（2）扩增引物及核酸探针序列设计，（3）超分支滚环扩增反应，（4）退火杂交，（5）纳米金探针的制备，（6）胶体金核酸试纸条的制备，（7）样品的检测。当样品中含有目的基因片段时，胶体金核酸试纸条的T线和C线处都会形成红线；若样品中不含目的基因片段，胶体金核酸试纸条只有C线处会形成红线。本发明可以快速、特异、灵敏、定性和定量检测食品样本中的食品致病菌，其探针设计简单，操作步骤简短，易于推广。

主权项

一种基于超分支滚环扩增的胶体金核酸试纸条检测食品致病菌的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）食品致病菌基因组DNA的提取及酶切提取食品致病菌的基因组DNA，根据食品致病菌的保守序列选择限制性内切酶对食品致病菌的基因组DNA进行酶切反应得到靶片段；（2）扩增引物及核酸探针序列设计根据步骤（1）得到的靶片段序列设计一条5’端磷酸化修饰的锁式探针；根据锁式探针序列设计两条扩增方向相反的引物1和引物2，引物1和引物2的5’端修饰有功能基团；设计一条与锁式探针互补的5’端含多聚A尾的单链DNA；设计一条5’端修饰有功能基团的多聚T探针；设计一条5’端修饰有功能基团的多聚A捕捉探针；（3）超分支滚环扩增反应连接反应：反应体系包括步骤（1）中所述的靶片段、步骤（2）中所述的锁式探针、连接酶及其缓冲液和双蒸水；消化反应：反应体系包括上述连接反应的产物、核酸外切酶及其缓冲液和双蒸水；扩增反应：反应体系包括上述消化反应的产物、步骤（2）中所述的引物1和引物2、dNTP、聚合酶及其缓冲液和双蒸水；（4）退火杂交将超分支滚环扩增反应产物与步骤（2）中所述的5’端含多聚A尾的单链DNA退火杂交；（5）纳米金探针的制备纳米金的制备：用柠檬酸盐还原法以氯金酸为原料制备纳米金；纳米金探针的制备：将步骤（2）中所述的多聚T探针与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针；（6）胶体金核酸试纸条的制备胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将底板、样品板、金垫、NC膜和吸水板按如下结构组装：底板在最下层，NC膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于NC膜的上部的一侧并与之重叠，样品板位于 金垫的上部与之重叠，吸水板位于硝酸纤维素膜的上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠；所述的金垫包埋有步骤（5）制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素的检测线和含链霉亲和素和多聚A捕捉探针的控制线；（7）样品的检测将由步骤（4）得到的退火杂交产物与柠檬酸钠缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加柠檬酸钠缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶片段存在，即有待测食品致病菌，仅有控制线变成红色表明没有待测食品致病菌。