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一种产透明质酸重组表达载体pQHK的构建方法，其特征在于按以下步骤进行：（1）构建含有透明质酸合成酶基因的表达载体pQEpmHas，用PCR扩增方法克隆源自多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida subsp. Multocida）中的透明质酸合成酶基因（Pasteurella multocidahyaluronic acid synthase PmHas）， 其PCR扩增克隆所用引物设计如下:上游引物pmHas P1 为 5'‑TAGGATCCATGAACACATTATCACAAGCAAT‑3'如序列表中SEQ ID No:3所示，含Bam H I位点GGATCC和起始密码子ATG；下游引物为pmHasP2 为 5'‑TAGAGCTCTTATAGAGTTATACTATTAATAAT‑3'如序列表中SEQ ID No:4所示，含Sac I位点GAGCTC和终止密码子TAA；PCR的模版为多杀巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因组DNA，扩增产物经Bam H I和Sac I双酶切后,连接入商用载体pQE80L中的相同酶切位点，插入片段经DNA 测序确证无突变后,将所获载体命名为pQEpmHas，基因为pmHas，该基因序列如序列表中SEQ ID No:1所示；（2）构建含尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的表达载体pQEkfiD，用PCR扩增方法克隆源自源于大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）菌株k5中尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因（K5 capsule gene D，kfiD），扩增的引物设计如下:上游引物KfiD P1: 5'‑ TGGAGATCTATGTTCGGAACACTAAAAATAACT G‑3'如序列表中SEQ ID No:5所示，含Bgl II 位点AGATCT，和起始密码子ATG；下游引物kfiD P2： 5'‑TTCTCGAGTTAGTCACATTTAAA CAAATCGCGAC‑3'如序列表中SEQ ID No:6所示，含Xho I位点CTCGAG和终止密码子TAA ；PCR的模版为大肠杆菌菌k5菌株ATCC 23500的基因组ＤＮＡ,成功扩增并纯化的产物, 经Ｂgl II和Xho I双酶切后,连接入Qiagen 公司的商用载体pQE80L的Bam H I和Sal I位点,所得载体经DNA 测序分析确证插入片段无突变后，所获载体命名为pQEkfiD，相应基因命名为kfiD基因，该基因序列如序列表中SEQ ID No:2所示；（3）构建大肠杆菌中共同表达透明质酸合成酶基因和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体：根据构建好的pQEkfiD载体的DNA 序列设计PCR引物，扩增T5 启动子驱动kfiD表达的片段 T5:kfiD，引物序列设计如下： 上游引物T5kfiD P1：5'‑TAGAGCTCCCTTTCGTCTTCACGTCGAGA‑3'如序列表中SEQ ID No:7所示，该引物含有Sac I 位点,GAGCTC，其中下标G 表示将原始pQE80L载体中C突变为G，以消除其Xhol 位点,CTCGAG；下游引物T5kfiD P2：5'‑TACTCGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCT‑3'如序列表中SEQ ID No:8所示，该引物含 Xho I 位点, CTCGAG ； PCR的模版用pQEkfiD载体，纯化的T5:kfiD扩增产物, 首先连接入pGEM‑T‑Vector并转化大肠杆菌JM109菌株，获中间载体pT‑T5KfiD，该载体中T5:kfiD片段如序列表中SEQ ID No:9所示，经测序分析证实核苷酸顺序无突变后，该插入pT‑T5KfiD片段经Sac I和Xho I 双酶切后,连接入表达载体pQEpmHas的Sac I和sal I 位点而获pmHas和kfiD基因在大肠杆菌中共表达的重组载体pQHK。 |
