一种纳米磁粒复合系统的制备方法

摘要

本发明是一种磁性纳米复合系统的制备方法，该方法是分别制备质粒pHRE-Egr-1-EGFP和PEI-Mn0.5Zn0.5Fe2O4纳米磁粒，再按PEI-MZF-NPs与pEgr1-HSV-TK质量比为40：1，将质粒pEgr1-HSV-TK和PEI-MZF-NPs分别用无血清培养基稀释，室温放置5分钟后，将二者混和到一起并混匀，置室温下孵育30分钟，即获得pEgr1-HSV-TK/PEI-MZF-NPs复合物。本发明制得的复合物转染肝癌Bel-7402细胞，获得了较高的转染效率，细胞毒性甚微，显示了比电穿孔转染法和脂质体转染法明显的优越性。

主权项

一种纳米磁粒复合系统的制备方法，包括下述步骤：（1）质粒pHRE‑Egr‑1‑EGFP的制备：将Egr1启动子置于pIRES载体上，其前有一CMV增强子片段，用以增强Egr1启动子表达效率，以CMVE‑Egr1p序列为模板设计引物，PCR扩增CMVE+Egr1p片段，回收CMVE‑Egr1p片段，以MluI+NheI为亚克隆位点，将其亚克隆至pCDNA3.1‑EGFP上，构建pCDNA3.1‑Egr1‑EGFP质粒；转化后，挑取若干个克隆，提取质粒，进行PCR鉴定；根据PCR电泳结果，选择正确的pCDNA3.1‑Egr1‑EGFP进行测序比对；合成5HRE，并在合成5HRE片段时，两侧各加若干个酶切位点，将其插入pUC57载体上，获得pUC57‑5HRE，将合成产物酶切鉴定、基因测序；将pUC57‑5HRE和pCDNA3.1‑Egr1p‑EGFP分别用MluI酶切连接，将连接产物转化至DH5α中，挑取克隆进行BglII酶切鉴定，选择正确的克隆进行测序，将测序序列与欲获得的5HRE序列进行比对；（2）PEI‑Mn0.5Zn0.5Fe2O4纳米磁粒的制备：按Mn：Zn：Fe的摩尔比为0.5:0.5:2称取原料MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O，混合后倒入高速研磨杯磨成粉状，按n(M)∶n(OH–)=1∶2.4，其中M代表所有金属离子，称取所需NaOH的量，加适量水溶解，将粉末倒入其中并混匀，不断搅拌成糊状，室温放置12h后，80℃干燥，得到粉末状前驱体，放入马弗炉中400℃焙烧1h, 自然冷却后热蒸馏水浸洗，过滤，用BaCl2检测滤液中无白色沉淀后，无水乙醇淋洗一遍，60℃烘干，即得Mn0.5Zn0.5Fe2O4纳米磁粒；称取一定量的Mn0.5Zn0.5Fe2O4纳米磁粒溶于去离子水中，配制成质量百分比为4%的磁流体，超声分散后高速离心弃上清；沉淀重悬于PBS缓冲液中，超声分散后按照PEI与MZF‑NPs质量比为1：5的量缓慢加入PEI，充分混匀，恒温摇床24h使反应充分；用磁分离法将磁性粒子从溶液中分离，经蒸馏水、甲醇反复洗涤，真空干燥后即获得表面修饰过的Mn0.5Zn0.5Fe2O4纳米磁粒；（3）复合物制备：按PEI‑MZF‑NPs与pHRE‑Egr‑1‑EGFP质量比为40：1，将质粒pHRE‑Egr‑1‑EGFP和PEI‑ MZF‑NPs分别用无血清培养基稀释，室温放置5分钟后，将二者混和到一起并混匀，置室温下孵育30分钟，即获得pHRE‑Egr‑1‑EGFP/PEI‑ MZF‑NPs复合物。