原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法

摘要

本发明公开了一种通过原生质体不对称融合技术创制抗霜霉病结球甘蓝新种质的途径，解决目前生产上基本没有对花科霜霉菌没有高抗甚至免疫的结球甘蓝品种，以及克服远源杂交不亲和和基因工程技术难度大、投资高等问题。一种原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法，其特征在于携带抗霜霉病基因的抱子甘蓝为供体，供体的原生质体经过UV射线处理；对霜霉病敏感且具有其它优良经济和农艺性状的结球甘蓝为受体，通过原生质体不对称融合途径创制抗霜霉病结球甘蓝新种质， 本发明将抱子甘蓝抗霜霉病基因转入结球甘蓝，建立了利用原生质体融合；技术进行快速抗病新种质的选育体系，建立了现代甘蓝种质资源创新及抗病育种高效技术平台。

主权项

一种原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法，其特征在于携带抗霜霉病基因的抱子甘蓝为供体，供体的原生质体经过UV射线处理；对霜霉病敏感且具有其它优良经济和农艺性状的结球甘蓝为受体，通过原生质体不对称融合途径创制抗霜霉病结球甘蓝新种质，该新种质是采用下述方法得到的：（1）首先通过苗期人工接种，筛选获得抗十字花科霜霉病的抱子甘蓝基因型，作为抗性基因供体材料； （2）易感霜霉病受体结球甘蓝原生质体的制备：采用酶解法分离和纯化易感霜霉病结球甘蓝的下胚轴原生质体，获得受体结球甘蓝原生质体；（3）抗霜霉病供体抱子甘蓝原生质体的制备：采用酶解法分离和纯化霜霉病抗性抱子甘蓝的叶肉原生质体，获得供体抱子甘蓝原生质体；（4）利用0.075 J·cm‑2 UV射线处理上述的供体抱子甘蓝原生质体；（5）用预融合液分别调整供体抱子甘蓝原生质体、受体结球甘蓝原生质体的浓度至2×106个·ml‑1，按1:1 的比例均匀混合得到原生质体悬液，将原生质体悬液用40％聚乙二醇融合液融合得到融合产物，原生质体培养基培养，于25℃暗培养；（6）融合后原生质体的培养及不定芽诱导，杂种植株再生，得到抗霜霉结球甘蓝新种质：植株开展度45 cm，外叶深绿，叶柄长，蜡粉中，外叶数12片，叶球圆，球色绿，球叶厚，中心柱短，单球重0.7 kg，高抗霜霉病，自交亲和，配合力好；所述的预融合液为：0.15 M 山梨醇、 0.03 M CaCl2·2H2O、0.075 M KCl、0.05M三羟甲基氨基甲烷盐酸， pH 7.2，过滤灭菌；所述的40％聚乙二醇融合液为：40％PEG1450、0.3M 葡萄糖、 50mM CaCl2·2H2O，pH7.0，过滤灭菌；所述的原生质体培养基为：B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分及150 mg·L‑1水解酪蛋白、 875 mg·L‑1二水合氯化钙、 45500 mg·L‑1山梨醇、 45500 mg·L‑1甘露醇、 2500 mg·L‑1葡萄糖、125 mg·L‑1 2‑脱氧‑核糖、 0.5 mg·L‑1 2,4‑二氯苯氧乙酸、 0.2 mg·L‑1萘乙酸、 0.2 mg·L‑1 6‑苄氨基嘌呤，pH 5.8 ‑ 6.0，过滤灭菌。