脓毒症早期诊断液相芯片及其制备方法

摘要

本发明公开了一种脓毒症早期诊断液相芯片，主要包括有：含有分别包被了PCT捕获抗体的微球，包被了CRP捕获抗体的微球，包被了IL-6捕获抗体的微球，和包被了新碟呤捕获抗体的微球，上述微球具有不同颜色编码；分别用生物素标记的检测抗体；链亲和素藻红蛋白。本发明所提供的脓毒症早期诊断液相芯片具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。同时，同步检测4种脓毒症特异性标志物，提高脓毒症早期诊断的敏感性和特异性，区分细菌和病毒感染引起的脓毒症，判断脓毒症的严重程度和不良预后，连续监测以判断病人对某种治疗方法的反应。

主权项

一种脓毒症早期诊断液相芯片，其特征是，主要包括有：1)包被微球：含有分别包被了降钙素原捕获抗体的微球，包被了C反应蛋白捕获抗体的微球，包被了白细胞介素‑6捕获抗体的微球，和包被了新喋呤捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；2)生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的降钙素原、C反应蛋白、白细胞介素‑6及新喋呤的检测抗体；3)链亲和素藻红蛋白；(1)每种相应的捕获抗体包被微球的制备如下：‑将50μL微球活化后，≥15000rpm，离心；‑吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230‑280μL 50mM的MES的溶液中，涡漩振荡30s，超声处理1min，后将微球于≥15000rpm，离心；重复该步骤；‑吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡30s，超声处理1min；‑往悬浮的微球中加入相应的0.8‑1.2μg抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450‑550μL；‑用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5‑2.5hr；‑偶联了抗体后的微球以≥12000g的速度，离心8‑12min；‑吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS‑TBN溶液中，涡漩振荡30s，超声处理1min；‑室温避光振荡30min；再于≥12000g，离心8‑12min；‑吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS‑TBN溶液中，涡漩振荡30s，超声处理1min；微球≥12000g，离心4‑6min；重复该步骤一次；‑吸弃上清，将微球重悬于500‑1000μL PBS‑TBN溶液中；‑每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2‑8℃避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为110‑140个/μl；(2)每种检测抗体的生物素标记的制备如下：‑依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积；‑用DMSO溶解，配制10mg/ml的NHS‑Biotin溶液；‑按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS‑Biotin溶液；‑加入体积为目标体积的1/10的pH8.9的NaHCO3溶液；‑加入pH7.4的PBS补至目标体积；‑包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3‑5小时，转速为800rpm‑1000rpm；‑将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS‑Biotin；‑使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到1‑3μg/ml。