一种基于雄激素受体介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的ELISA试剂盒

摘要

本发明涉及一种基于雄激素受体介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的ELISA试剂盒。本发明试剂盒包含：探针，雄激素受体蛋白，结合缓冲液，一抗包被的聚苯乙烯酶标板，酶混合液，底物显色液，终止液，10×浓缩洗涤液，标准品，质控品。所述探针为5′端用生物素标记的双链DNA，该序列含有至少一个雄激素反应元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′，通过与以睾酮或双氢睾酮为标准品所作的标准曲线作比对，确定待测样品中类雄激素物质相对于双氢睾酮的毒性当量。本发明试剂盒操作简便、灵敏、通量高，检测限可达pM级。可广泛用于食品、环境检测等领域。

主权项

一种基于介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的ELISA试剂盒，其特征在于其组成包括：探针，雄激素受体蛋白，结合缓冲液，一抗包被的聚苯乙烯酶标板，酶混合液，底物显色液，终止液，10×浓缩洗涤液，标准品，质控品；所述探针为5’端用生物素标记的双链DNA，该序列含有两个雄激素反应元件核心序列5’‑GGAACAnnnTGTATC‑3’，其中n为任意核苷酸，能特异结合配体‑雄激素受体二聚体；所述结合缓冲液每升由5g Tris‑HCl，0.5g EDTA，30g KCl，0.3g二硫赤藓糖醇，2g牛血清白蛋白，50ml甘油及余量为去离子水组成；所述一抗包被的聚苯乙烯酶标板所包被的一抗为雄激素受体单克隆抗体；所述酶混合液为含有链亲和素标记的辣根过氧化物酶的PBS缓冲液；所述底物显色液分为A、B两种，A为过氧化氢、B为四甲基联苯胺；所述终止液为1mol/L的硫酸；所述10×浓缩洗涤液每升由80g NaCl，11.5g Na2HPO4 ·2H2O，2g KH2PO4，2g KCl，5ml Tween‑20，0.5g poly(dI:dC)及余量为去离子水组成的混合液；所述标准品为1×10‑6 mol/L的睾酮或双氢睾酮；质控品为5ng/ul的所述探针，所述探针的核苷酸正链序列为SEQ No1，探针的核苷酸互补序列为SEQ No2。2.一种采用权利要求1所述试剂盒进行检测环境类雄激素毒性当量的方法，包括以下步骤：(1) 标准品用结合缓冲液稀释为1×10‑6 mol/L～1×10‑12 mol/L共7个梯度；雄激素受体蛋白用结合缓冲液稀释为2×10‑9 mol/L；10×浓缩洗涤液用去离子水稀释为1×洗涤液；(2) 受体配体体外结合：总体积100ul，其中含50ul标准品或50ul含环境类雄激素的待检样品，50ul稀释后的雄激素受体，于4℃振摇孵育1小时，然后37℃孵育30分钟，再加入核苷酸正链序列为SEQ No1的探针1ul，37℃反应10分钟，成生物素DNA探针‑雄激素受体‑环境类雄激素复合物；以50ul不含样品或不含标准品的结合缓冲液作为本底对照；所有反应均做复孔；(3) ELISA反应：将步骤（2）的复合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶标板中，室温孵育1小时，弃上清，350ul 1×洗涤液洗涤5次；加入50ul含有链亲和素标记的辣根过氧化物酶的PBS缓冲液，37℃孵育0.5‑1小时，弃上清，350ul 1×洗涤液洗涤5次；加入底物显色液A和B各50ul，37℃孵育15分钟，加入50ul终止液；同时将质控品作为ELISA的阳性对照，以及试剂空白作为ELISA的阴性对照；(4) 酶标仪检测：在ELISA检测仪上，以试剂空白阴性对照调零，以630nm波长做校正，于450nm波长处，测定各孔吸光度值；(5) 结果计算：相对结合量=样本或标准品吸光度值‑本底对照吸光度值，与以睾酮或双氢睾酮为标准品所作的标准曲线作比对，确定待测样品中类雄激素物质相对于睾酮或双氢睾酮的累计当量。