主权项 |
1.一种利用SSR引物鉴定大麦品种的方法,包括提取供试品种样品的DNA、用SSR引物进行PCR扩增,对PCR扩增产物进行凝胶电泳,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染,SSR谱带分析,其特征在于:所述的供试品种样品至少为两个大麦品种,所述的SSR引物包括14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物,其中,14对基本核心SSR引物为Bmag0211、Bmag0378、Bmag0711、Bmac0209、Bmag0877、EBmac0701、EBmac0635、Bmag0353、Scssr10148、Scssr03907、Bmag0009、Bmag0867、HVCMA和EBmac0603对应的引物,14对扩展核心SSR引物为Scssr02748、HVM54、Scssr07759、HvXan、HVM27、HVM60、HVM40、Bmac0181、Scssr07106、Bmag0387、Bmac0018、Scssr09398、Bmac0064和Scssr15864对应的引物;具体步骤如下:提取供试品种样品的DNA;用14对基本核心SSR引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增,其中的PCR扩增反应总体积为25μL,扩增反应体系为:SuperTaq®5U/μL的DNAPolymerase0.2μL,2.5mmol/L的dNTP2μL,含Mg<sup>2+</sup>的10×PCRBuffer2.5μL,10μmol/L的每对引物的上游和下游引物各1μL,供试大麦品种基因组20ng/μL的DNA模板1μL,双蒸水补足25μL;PCR反应程序为94℃预变性5min,35个扩增循环,94℃30sec,47~62℃30sec,72℃1min,72℃延伸5min,4℃保存;供试大麦品种PCR扩增产物进行凝胶电泳,变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%,凝胶组分为:6%变性聚丙烯酰胺溶液60mL,TEMED50μL,10%过硫酸胺500μL;设定功率50W,1×TBE缓冲液电泳2h,关闭电源,进行染色;染色过程是:10%冰醋酸溶液固定20min,超纯水迅速水洗,0.2%硝酸银溶液银染30min,超纯水再次迅速水洗,显影液显色数分钟,直至条带清晰,10%冰醋酸溶液终止5min,超纯水再次水洗;通过分析基本核心SSR结果,大麦品种间多态性位点的差异,确定等位变异数及多态性信息含量,在相同迁移率位置上进行“1、0”标注,构建大麦品种的SSR分析谱带数据,利用这些数据对来源不明的大麦品种进行比较,如果品种间差异位点数≥3,判定为不同品种,形成鉴定结果;如果品种间差异位点数小于2,则转入e步骤;再用14个扩展核心SSR引物对采用供试品种模板DNA进行PCR扩增,其中的PCR扩增反应总体积和扩增反应体系均与b步骤相同;并按照d步骤进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染;综合分析基本核心SSR和扩展核心SSR引物的结果,确定等位变异数及多态性信息含量,在相同迁移率位置上进行“1、0”标注,构建大麦品种的SSR分析谱带数据,品种间差异位点数≥3,判定为不同品种;品种间差异位点数为1或2,判定为近似品种;品种间差异位点数为0,判定为疑同品种,形成鉴定结果;所述的6%变性聚丙烯酰胺溶液为420g尿素,10×TBE50mL,40%PAG150mL,去离子水定容至1000mL;所述的10%冰醋酸溶液是将100mL冰醋酸,加入1000mL去离子水;所述的0.2%硝酸银溶液是将2.0g硝酸银,溶于1000mL去离子水中;所述的显影液是将15g氢氧化钠溶于1000mL去离子水中,再加入5mL甲醛。 |