转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗的方法

摘要

本发明公开了一种转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗的方法，尤其是将盐藻自身的调控元件引入并构建含有禽流感病毒HA、NA重组基因的双元表达载体，然后转化盐藻，经筛选和鉴定，确定高表达重组C3d-H5N1融合蛋白的盐藻转化藻株。再通过稳定表达C3d-H5N1融合蛋白转化藻株的放大和大规模开放培养，离心收集藻细胞，冷冻干燥，无菌条件下分装、制备成口服型禽流感疫苗胶囊。本方法制备的盐藻转化藻株，可供开放培养，因此产量高、成本低，从而实现转基因盐藻制备口服型动物禽流感疫苗的规模化生产，满足市场需求。

主权项

一种转基因盐藻制备口服型禽流感疫苗的方法，其特征在于：是将盐藻自身的调控元件引入并构建含有禽流感病毒HA、NA重组基因的双元表达载体，然后转化盐藻，经筛选和鉴定，确定高表达重组C3d‑H5N1融合蛋白的盐藻转化藻株；再通过稳定表达C3d‑H5N1融合蛋白转化藻株的放大培养，制备成口服用禽流感疫苗，其中盐藻自身的调控元件引入并构建含有禽流感病毒HA、NA重组基因的双元表达载体的方法包括：①中间载体 p7‑Pnr‑nr‑Tnr的构建：利用盐藻NR基因5’上游序列Pnr和3’ 端序列Tnr 分别作为启动子和终止子，以盐藻硝酸盐还原酶NR基因为选择标记基因，将Pnr、NR基因和Tnr切下、补平，顺序连接成Pnr‑nr‑Tnr表达盒，并在表达盒的上下游均引入Xho I位点，连接入质粒pGEM‑7zf(+)的Xho I位点，构建中间载体p7‑Pnr‑nr‑Tnr；    ②中间载体pActin‑C3d‑H5N1的构建：将小鼠补体C3d基因片段和禽流感病毒H5N1血凝素HA基因、神经氨酸酶NA基因顺序连接成C3d‑H5N1融合基因；以盐藻actin基因启动子Pat和终止子Tat为表达调控元件，以C3d‑H5N1融合基因为外源基因，将Pat序列、C3d‑H5N1融合基因、Tat序列切下、补平，顺序连接成Pat‑C3d‑H5N1‑Tat表达盒，并在表达盒的上下游均引入Xba I位点，连接入质粒pUC18的Xba I位点，构成中间载体pActin‑C3d‑H5N1；③盐藻双元表达载体pMNCH的构建：利用盐藻DSM1序列，分别切下、补平，同向连接到载体pUC18的EcoR I/Hind III位点，并在两个序列间添加Xba I和Xho I位点，构建成含两个同向的盐藻DSM1序列的中间载体pDMM；将上述构建的中间载体p7‑Pnr‑nr‑Tnr和pActin‑C3d‑H5N1分别用Xho I切下Pnr‑nr‑Tnr表达盒，用Xba I切下Pat‑C3d‑H5N1‑Tat表达盒，再依次插入中间载体pDMM的Xho I位点和Xba I位点，酶切鉴定其方向，挑选片段方向与盐藻DSM1序列相同的克隆，构建成高效的禽流感基因盐藻双元表达载体pMNCH。