利用酵母甘露糖异构酶基因筛选水稻转基因植株的方法

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用酵母甘露糖异构酶基因筛选水稻转基因植株的方法。其步骤包括引物设计、PCR扩增、载体构建、遗传转化、筛选、鉴定等步骤。从真核生物酿酒酵母中克隆到的磷酸甘露糖异构酶PMI基因，以其作为筛选标记，通过农杆菌介导将PMI基因导入受体水稻，将转化后的水稻愈伤组织在不同浓度梯度甘露糖的培养基上进行筛选获得转基因植株。本发明的优点是在植物转化及筛选过程中不需要添加抗生素和除草剂，并且转基因植物本身也不含有抗生素基因或抗除草剂基因，对环境和人体安全。

主权项

一种利用酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶基因PMI获得转基因水稻的方法，其特征在于，以酿酒酵母甘露糖异构酶基因PMI作安全转基因筛选标记，通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的PMI基因导入受体水稻中，利用甘露糖代替抗生素或除草剂作筛选剂，对转化后的受体细胞进行筛选，通过PCR和RT‑PCR检测，筛选获得转基因植株，其制备步骤如下：1)使用XhoI限制性内切酶对质粒pCAMBIA1303进行酶切，将其中的潮霉素基因hpt切掉，得到不含潮霉素基因hpt的载体片段；2)设计一对特异引物，其核苷酸序列如下所示：正向引物P1：5′‑GCCTCGAGCCAGAAAATTTTAAAAACATG‑3′，反向引物P2：5′‑GCCTCGAGAGAAAGAAAGCTAATTTGG‑3′；利用上述引物扩增酿酒酵母磷酸甘露糖异构酶PMI基因，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA片段；3)将步骤2)所述的DNA片段连接到到步骤1)得到的质粒pCAMBIA1303中，构建得到表达质粒pPMI；4)将步骤3)的表达质粒pPMI转化根癌农杆菌，得到含有pPMI质粒的根癌农杆菌，将所述的根癌农杆菌培养于YEP培养基中，得到转化菌株；5)将水稻种子接种在愈伤组织诱导培养基上获得愈伤组织，备用；或将获得的愈伤组织在继代培养基上继代两次，备用；6)将步骤5)得到的愈伤组织转移至预培养的预培养基中，于暗处培养四天；7)将步骤6)得到的愈伤组织置于含有步骤4)根癌农杆菌的侵染培养基中，侵染愈伤组织30min，农杆菌的菌液浓度OD600＝1.0，共培养3天；8)利用甘露糖筛选培养基中的甘露糖浓度由低到高逐步筛选阳性愈伤组织；9)将步骤8)的愈伤组织在分化培养基上诱导分化；在生根培养基上诱导生根，得到转基因水稻植株；10)利用PCR和RT‑PCR方法鉴定转基因植株；其中步骤5)所述的愈伤组织诱导培养基按以下配方：KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4‑D 2.5mg/L，水解酪蛋白600mg/L，30g蔗糖；3g/L Phytage；pH5.8；将步骤6)的预培养基按以下配方制备：KNO3 1415mg/L，NH4SO4 231.5mg/L，CaCl2·2H2O 83mg/L，MgSO4·7H2O 92.5mg/L，KH2PO4 200mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，MnSO4·4H2O 2.2mg/L，ZnSO4·7H2O 0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI 0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4‑D2.5mg/L，100μM乙酰丁香酮，水解酪蛋白600mg/L，30g/L蔗糖，8g/L琼脂糖；pH5.6；步骤7)所述的侵染培养基按以下配方制备：KNO3 1415mg/L，NH4SO4 231.5mg/L，CaCl2·2H2O 83mg/L，MgSO4·7H2O 92.5mg/L，KH2PO4 200mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，MnSO4·4H2O 2.2mg/L，ZnSO4·7H2O 0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI 0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4‑D2.5mg/L，乙酰丁香酮100μM，水解酪蛋白1000mg/L，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖；pH5.4步骤7)所述的共培养培养基按以下配方制备：KNO3 1415mg/L，NH4SO4 231.5mg/L，CaCl2·2H2O 83mg/L，MgSO4·7H2O 92.5mg/L，KH2PO4 200mg/L，FeSO4·7H2O 13.9mg/L，MnSO4·4H2O 2.2mg/L，ZnSO4·7H2O 0.8mg/L，H2BO3 0.4 KI 0.8mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4‑D2.5mg/L，100μM乙酰丁香酮，水解酪蛋白1000mg/L，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，8g/L琼脂糖；pH5.6步骤8)所述的甘露糖筛选培养基按以下配方和步骤制备：第一次筛选用培养基：KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4‑D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖5g/L，蔗糖15g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；第二次筛选用培养基：KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4‑D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖11g/L，蔗糖9g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；第三次筛选用培养基：KNO3 2830mg/L，NH4SO4 463mg/L，CaCl2·2H2O 166mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4 400mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.6mg/L，H2BO3 0.8 KI 1.6mg/L，甘氨酸2mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，2，4‑D2.5mg/L，水解酪蛋白500mg/L，潮霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，甘露糖15g/L，蔗糖5g/L，Phytagel 4g/L；pH5.8；步骤9)所述的分化培养基的配方如下：MS培养基的无机盐的大量成分，N6培养基的无机盐的微量成分，6‑BA2mg/L，KT2mg/L，NAA0.2mg/L，IAA0.2mg/L，水解酪蛋白600mg/L，脯氨酸300mg/L，潮霉素50mg/L，30g/L蔗糖，03g/L Phytage；pH5.8；步骤9)所述的生根培养基的配方如下：1/2MS培养基，20g/L蔗糖，3g/LPhytage；pH5.8。