小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法。该方法包括标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备以及有效性验证及结果检测判定步骤；其中特异性引物的正向引物的序列为：5’-CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG-3’，反向引物的序列为：5’-CATGGCCCTATAATACGGGT-3’；所述荧光探针的序列为：5’-CTCGCTCTATGACCTACTGC-3’。本发明检测灵敏度高，检测时间短，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。

主权项

小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法所使用的寡核苷酸组，其特征在于，所述寡核苷酸组包括特异性引物及荧光探针，所述特异性引物为正向引物PrimerF、反向引物PrimerR；正向引物的序列为：5’‑CCCGAAGTGGTTAGTGAAGG‑3’，反向引物的序列为：5’‑CATGGCCCTATAATACGGGT‑3’；所述荧光探针的序列为：5’‑CTCGCTCTATGACCTACTGC‑3’；所述的小鼠肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括有标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备、有效性验证及结果检测判定，所述实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线的步骤为：(1)模板的制备：将构建的标准质粒作10倍系列稀释，以稀释液为模板；具体如下：定量标准质粒为2.94×109拷贝/μl，用稀释液将标准质粒按10倍稀释，即稀释成浓度分别为1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104的稀释液，稀释液在‑20℃条件下保存备用；(2)实时荧光定量PCR反应体系：25μl的PCR反应体系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCRbuffer，2.5μl；10mM dNTPs，0.5μl；1.25U Tag DNA聚合酶，0.25μl；300nM正向引物PrimerF，2.5μl；300nM反向引物PrimerR，2.5μl；模板，1μl；与模板DNA配对的荧光探针；(3)循环反应：根据步骤(2)中的PCR反应体系加样，将加好样的PCR试剂管放入荧光PCR仪中，设置相应的荧光采集条件后进行扩增，反应循环程序为：(a)、95℃预变性5min，1个循环；(b)、95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环后反应结束，得到反应产物；(4)建立检测标准曲线：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线。