一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，它的步骤如下：（1）设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物；（2）PCR扩增及重组质粒的构建；（3）基因的诱导表达与蛋白质的纯化。本发明该酶活性最适酶活性为90℃，具有较为宽的酶适应温度，在50-100℃之间具有很高的酶活性；该酶的最适酶活pH为5.4，具有较好的耐酸性，在高温70℃和酸性条件pH为5.0处理36小时，仍保持50%以上的活性。

主权项

一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：（1）设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物，引物的序列如下：上游引物 P1：5′‑ GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC‑3′；下游引物 P2：5′‑ GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC‑3′；（2）PCR扩增及重组质粒的构建： 以嗜热细菌全基因组序列为模板进行扩增，PCR扩增条件如下：94℃ 预变性5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证；（3）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：将重组质粒转化E. coli BL21‑codonPlus(DE3)‑RIL，加入0.5‑1 mol/L IPTG于37℃继续培养3‑5 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析，得到纯化的酶蛋白。