一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法

摘要

本发明公开了一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，利用发根农杆菌菌液侵染黄芩外植体，诱导黄芩外植体形成毛状根，黄芩毛状根在MS固体培养基上呈黄色毛发状，能稳定合成黄芩苷，对其ITS测序，鉴定该毛状根为黄芩属黄芩毛状根。然后在选育培养基中进一步选育，优化培养条件，以选育提高毛状根中药用有效成分黄芩苷的含量的株系。通过发根农杆菌诱导黄芩属黄芩得到毛状根，诱导率可达10～40％，所得黄芩毛状根呈黄色毛发状，能稳定合成黄芩苷，本发明将黄芩属黄芩毛状根在优化培养基上培养，其生长迅速，在30～35天其生物量能增值23～35倍，并且只需在黑暗条件下培养，低能耗，低成本，适合工业化生产。

主权项

一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将无菌的黄芩外植体接种于预培养基上，25～28℃黑暗条件下预培养2～3d；所述的预培养基为含有0.15～1.0mg/kg 6‑BA和0.1～0.35mg/kg NAA的MS固体培养基；2）在预培养的黄芩外植体上划痕，加入活化的发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）的菌液，并添加乙酰丁香酮，使其终浓度为200～600μg/mL，感染10～30min；将黄芩外植体转移到MS固体培养基上，25～28℃黑暗培养2～3d，再转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25～28℃黑暗培养，诱发毛状根；所述的发根农杆菌为发根农杆菌A4、发根农杆菌A49615或发根农杆菌1.2556；3）待经发根农杆菌感染的黄芩外植体上长出的毛状根达到2～3cm时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25～28℃黑暗培养，直至发根农杆菌生长被抑制，然后切取毛状根；4）将切取的毛状根接种于MS固体培养基上，25～28℃避光培养，每30天继代培养一次；5）选取MS固体培养基继代培养2次以上、生长旺盛的毛状根，接种到MS液体培养基上，100～200r/min振荡、25～28℃避光培养，筛选生长迅速、能稳定产生黄芩苷的黄芩毛状根株系；6）选取MS液体培养基中生长旺盛的黄芩毛状根株系，切取根尖部分，接种到优化培养基上，100～200r/min振荡、25～28℃避光培养，培养到32～38d补加培养液，培养至60～80天收获毛状根；所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加10～60g/L的碳 源、0.3～1.0g/L的氮源、20～100mg/L的生物诱导子、5.3×10‑5～3.0mmol/L的非生物诱导子和0.2～0.6mg/L的外源激素，pH值为4.0～7.0；所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ca2+、Mg2+或Co2+；外源激素为NAA或6‑BA；所述的毛状根液体基本培养基为MS培养基或采用以下配方：包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5.8～6.0；所述的大量元素为KNO3：950mg/L、KH2PO4：42.5mg/L、MgSO4·7H2O：185mg/L和CaCl2·2H2O 220mg/L；微量元素为KI：0.83mg/L、H3BO3：6.2mg/L、MnSO4·4H2O：22.3mg/L、ZnSO4·7H2O：8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O：0.25mg/L、CuSO4·5H2O：0.025mg/L和CoCl2：0.025mg/L；铁盐为Na2·EDTA：18.65mg/L和FeSO4·7H2O 13.9mg/L；有机成分为肌醇：100mg/L、甘氨酸：2mg/L、盐酸硫胺素：0.1mg/L、盐酸吡哆醇：0.5mg/L和烟酸：0.5mg/L。