一种番茄灰霉菌毒素的提取和纯化方法

摘要

本发明涉及农业生物技术领域，具体讲是一种番茄灰霉菌毒素的提取和纯化方法。该方法经病原菌的分离纯化、毒素粗提液的制备、薄层层析技术、毒素的生物测定等步骤提取和纯化灰霉菌毒素。本发明的提取纯化技术简单易行，安全性高，成本低，可以用于抗番茄灰霉病突变体技术的研究。

主权项

一种番茄灰霉菌毒素的提取和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）病原菌分离、纯化：采集感染番茄灰霉菌（Botrytis cinerea Pers）的病叶或病果，灭菌处理后，在叶片病健交接处剪取边长约3mm的小块接入PSA平板内或用接种针接触果实霉层并在PSA平板上划线，分离培养1‑2d后挑取单菌丝，接入PSA平板，纯化2‑3次后，转接于PSA斜面培养基中，4℃保存；（2）病原菌活化：灰霉菌株从斜面上培养基上接种于PSA平板，置于25℃环境中培养3天；（3）毒素提取：A：Czapek‑Dox培养液的配制其配方为：葡萄糖50.0g，酵母浸出液1.0g，NaNO3 2.0g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，用蒸馏水定容至1000ml；B：毒素产生在灰霉菌丝将要长满PSA平板时，使用打孔器沿菌落边缘依次打取直径5mm的菌碟，将打好的菌碟接入Czapek‑Dox培养液中，16菌片/500ml培养液，25℃条件下黑暗培养21d，每天振荡培养1h，120r/min；C:减压浓缩用双层纱布滤去菌丝，在50‑60℃下进行减压浓缩；D：毒素提取将浓缩后的滤液加等体积的有机溶剂乙酸乙酯于分液漏斗中，充分振荡10‑15 min，静置15min，移去下层溶液，上层溶液重复萃取2‑3次，收集下层溶液，进行减压浓缩，用旋转蒸发仪去除溶剂，得到棕褐色物质，用分析天平称质量，按100g/L的浓度加丙酮溶解，即获得毒素粗提液；（4）提取液薄层层析A：薄层层析板的制作按质量比硅胶GF254:羧甲基纤维素钠CMC:H2O=0.4:0.007:1的比例混合，先将CMC与H2O混合溶解均匀，再加入硅胶研磨，使之完全混匀，将配制好的浆料铺在干燥洁净的玻璃板上，使其表面均匀平滑，厚度1mm，涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干，晾干后，放在烘箱内加热活化，硅胶板在烘箱中渐渐升温，维持105℃‑110℃活化30min；B：点样在距薄层板一端1.5cm处用铅笔轻轻划一起始线，用0.5mm毛细管将毒素粗提液点在起始线上，待丙酮挥发后在起始线上重复点样2‑3次，使点样原点直径为3mm；C：展开待丙酮挥发后，将点好样品的薄层板放入内衬滤纸的展开槽中，展开槽内预先已放置由体积比正己烷:乙酸乙酯 = 7:3组成的展开剂，展开剂浸没薄层板点样起始线的一端0.5cm，薄层板与水平成45‑60°角，盖好槽盖，让薄层板在密闭的展开槽中，展开剂在薄层板上展开，当展开剂前沿上升至距点样基线13 cm处时，取出层析板，立即用铅笔在展开剂上端前沿处划记号，置空气中晾干；D：显色待板自然风干后，放在紫外254nm下观察；（5）提取物洗脱各个样品间隔一定距离点在起始线上，每个样品在起始线上的点样点为原点，层析后计算各组分 Rf 值：原点到组分斑点中心的距离与原点到展开剂前沿的距离（13 cm）的比值；对具有相同Rf 值的各组分连同吸附剂一起刮下，然后用2‑5ml的丙酮将被分离的物质从吸附剂上洗脱下来，各洗脱液12 000rpm下离心10min，得到上清液；（6）提取物生物测定培养皿中先铺一张浸有无菌水的滤纸，取3‑4叶期番茄植株叶片，75%酒精消毒后平铺到滤纸上，每皿放3片，用接种针轻轻刺破叶片，滴入20μl上清液，置于25℃光照培养箱中，3次重复，设同样浓度的丙酮溶液作为对照，5天后观察叶片的变化；（7）提取物保存对能在叶片上产生类似于灰霉菌感染后的病斑的上清液，作为层析纯毒素，4℃下保存备用。