一种利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法

摘要

本发明涉及PCR检测领域，具体涉及一种利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法，其中所述原虫为贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫。本发明检测方法是根据鸭环孢子虫ITS-1基因，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因和贝氏隐孢子虫ITS-1+片段，分别设计出3对特异性引物，通过多重PCR反应可以快速准确地检测鸭粪中的贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫卵囊，对鸭的隐孢子虫病、环孢子虫病和球虫病作出鉴别诊断。本发明检测方法可以同时检测三种原虫，敏感性、特异性好，比常规PCR更加快捷经济，可用于鸭肠道原虫病的鉴别诊断和分子流行病学调查或水源性隐孢子病和环孢子虫病爆发的风险评估。

主权项

1.一种利用多重PCR检测鸭粪中三种原虫的方法，所述原虫为贝氏隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫，其特征在于所述检测方法是根据鸭环孢子虫ITS-1基因，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因和贝氏隐孢子虫ITS-1+片段，分别设计出3对特异性引物，引物序列如SEQ ID NO：1～6所示，通过多重PCR反应结果来检测样本是否为鸭隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫，其中，鸭环孢子虫ITS-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，菲莱氏温扬球虫18SrRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述方法具体包括如下步骤：(1)样本的预处理：取样本10g，用PBS-0.1％Tween稀释到20mL，旋涡振荡，用100目尼龙筛过滤，滤液2000r/min离心10min，反复用PBS液洗涤三次，离心，取沉淀备用；(2)样本DNA的提取；(3)多重PCR扩增：扩增体系如下：扩增条件为预变性94℃，5min；变性94℃，30s；退火47.6℃，40s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10min；其中，变性、退火和延伸为35个循环；(4)PCR产物观察：取扩增产物加样于琼脂糖凝胶上，电泳后，紫外灯下观察到一条与阳性对照同一位置出现的288bp、402bp和694bp的片段，即为鸭隐孢子虫、环孢子虫和菲莱氏温扬球虫阳性