固相多肽合成阿托西般的制备方法

摘要

本发明公开了一种固相多肽合成阿托西般的制备方法，包括如下步骤：以RinkAmide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸，最后一个肽链使用保护的巯基丙酸(Map(SX))；得保护的九肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽；然后切肽，收集还原型阿托西般粗品；调节pH到7.5-10.0，收集氧化型阿托西般粗品；再通过制备型HPLC(C18或C8柱)分离纯化，获得目标产物。本发明的方法，原料来源方便，简化了工艺，降低了成本；三废污染少，且收率高，便于工业化实施，具有较大的产业化前景。

主权项

固相多肽合成阿托西般的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，用TBTU/HOBt、HBTU/HOBt、BOP/HOBt、TBTU/HOAt、HBTU/HOAt或BOP/HOAt为缩合剂进行接肽反应，逐个接上氨基酸，最后接上巯基丙酸Mpa；得保护的九肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽；具体的包括如下内容：①树脂的预处理：将Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂，用DMF浸泡0.5～2小时，使树脂充分溶胀，氮气吹干，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～80℃反应10～60分钟，氮气吹滤去除六氢吡啶，DMF洗涤，氮气吹干；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶∶DMF＝1∶3～5体积比；六氢吡啶的DMF溶液中，Rink Amide MBHA树脂的浓度比为：1克/5～15ml；②Fmoc‑Gly‑树脂的制备将步骤①预处理的树脂与Fmoc‑Gly‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物在10～60℃的条件下反应0.5～3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；Fmoc‑Gly‑OH的摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；然后加入六氢吡啶的DMF溶液，10～60℃反应10～60分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得Fmoc‑Gly‑树脂；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；③Fmoc‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂的制备：在步骤②的Fmoc‑Gly‑树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～60℃反应10～60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Orn(Boc)‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，10～60℃反应0.5～3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；反应体系中：Fmoc‑Orn(Boc)‑OH的摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；④Fmoc‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂的制备在步骤③的Fmoc‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～60℃反应10～60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Pro‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，10～60℃反应0.5～3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；反应体系中：Fmoc‑Pro‑OH的摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；⑤Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂的制备在步骤④的Fmoc‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～60℃反应10～60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物10～60℃反应0.5～3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；反应体系中：Fmoc‑Cys(Trt)‑OH的摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；⑥Fmoc‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂的制备在步骤⑤的Fmoc‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～60℃反应10～60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物10～60℃反应0.5～3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；反应体系中：Fmoc‑Asn(Trt)‑OH的摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；⑦Fmoc‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂的制备在步骤⑥的Fmoc‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～60℃反应10～60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物10～60℃反应0.5～3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；反应体系中：Fmoc‑Thr(tBu)‑OH的摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；⑧Fmoc‑Ile‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂的制备在步骤⑦的Fmoc‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～60℃反应10～60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干，加入Fmoc‑Ile‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物10～60℃反应0.5～3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑Ile‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；反应体系中：Fmoc‑Ile‑OH的摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml⑨Fmoc‑D‑Tyr(OEt)‑Ile‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂的制备在步骤⑧的Fmoc‑Ile‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～60℃反应10～60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc‑D‑Tyr(OEt)‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物10～60℃反应0.5～3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc‑D‑Tyr(OEt)‑Ile‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂；NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；反应体系中：Fmoc‑D‑Tyr(OEt)‑OH的摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；⑩Mpa‑D‑Tyr(OEt)‑Ile‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂的制备在步骤⑨的Fmoc‑D‑Tyr(OEt)‑Ile‑Thr(tBu)‑Asn(Trt)‑Cys(Trt)‑Pro‑Orn(Boc)‑Gly‑树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～60℃反应10～60分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入Mpa、TBTU、HOBT、NMM和DMF，将混合物10～60℃反应0.5～3.0小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；反应体系中：Mpa的摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2‑6倍；甲醇洗涤，抽干，氮气吹干，得保护还原型阿托西般树脂；(2)然后加入切肽试剂TFA/HBr/HAc/TIS/EDT进行切肽；具体配比为800‑900ml/25‑40ml/5‑20ml/40‑60ml/20‑30ml；10～60℃反应2‑6小时；(3)以乙醚为溶剂，沉淀并收集还原型阿托西般粗品；(4)将还原型阿托西般粗品溶于水中，用氨水调节PH到7.5‑10.0，收集氧化型阿托西般粗品；(5)将收集的粗品通过制备型HPLC，填料为C18分离纯化，获得目标产物；流动相为：0.1‑0.9M醋酸盐缓冲液∶乙腈等于70‑90∶30‑10，体积比；或0.1‑0.9M磷酸盐缓冲液∶乙腈等于70‑90∶30‑10，体积比；或0.05％‑0.1％三氟醋酸缓冲液∶乙腈等于70‑90∶30‑10，体积比。