主权项 |
一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法,其特征在于包括以下步骤:(1)合成甲型流感病毒全长M2蛋白基因;(2)基因合成后,插入克隆质粒;(3)根据甲型流感病毒全长M2蛋白基因序列,设计用于扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因的引物,在上游引物的3’端引入BamHI酶切位点,在下游引物的3’端引入HindⅢ酶切位点及6个组氨酸标签序列,以合成的甲型流感病毒全长M2蛋白基因为模板扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因,产物与用同样酶切后的pMAL‑p2X表达质粒片段连接;(4)连接产物转化大肠杆菌,挑选阳性克隆,测序,得到pMAL‑p2X MBP‑M2‑6×His重组质粒;(5)重组质粒pMAL‑p2X MBP‑M2‑6×His接种LB培养基,按1:2000~1:300(V/V)转接到含有10L LB培养基的15L的发酵罐中,以200rpm转速37℃培养4~6h,菌液OD600达到0.5~0.6时,接种浓度0.5~0.7mmol/L加入IPTG诱导4h,4000rpm离心40min,获得细菌培养物25~30g;(6)细菌膜蛋白提取和纯化a细菌膜蛋白提取将步骤(5)得到的细菌培养物在冰浴中完全融化,重悬于层析平衡液中,超声破碎后以100,000g离心1h分离上清和沉淀,沉淀重悬于层析平衡液,加入不同的裂解剂在4℃搅拌2h提取膜蛋白,测定提取物的活性,以确定总蛋白和裂解剂的比例,提取物以100,000g离心1小时,获得可溶性上清,再用层析平衡液稀释至最终裂解物的浓度为1.0%(w/v)以便于后续纯化;其中,所述的层析平衡液中含有20mmol/LTris,0.2mol/L NaCl,1mmol/L2‑巯基乙醇,1mmol/L EDTA以及20‑120ml/L蛋白酶抑制剂,pH8.0;其中,所述的裂解剂为1%Triton‑X100;b麦芽糖结合蛋白‑M2纯化在4℃条件下,10ml Amylose介质装柱、用三倍柱床体积含1.0%(v/w)Triton‑X100平衡液平衡,以1ml/min的速度进行虹吸上样,上样后用10倍柱床体积含1.0%(v/w)Triton‑X100平衡液冲洗,再用三倍柱床体积不含裂解剂的平衡液冲洗,用含10mmol麦芽糖的平衡液洗脱,分步收集,测定蛋白含量、纯度和活性;c酶切和纯化按75‑100ug蛋白加入1单位的Xa因子常温反应36‑48h,使酶切程度达到90‑95%,酶切后样品经缓冲液1(50mmol Sodium phosphate pH8.0,0.3mmolNaCl)充分透析,移入15ml离心管和已经平衡Ni+介质2ml在4℃条件下旋转混合4h,在常温以4000r/min离心1min除去上清,用缓冲液1充分洗涤,含0.25mmol/L咪唑的缓冲液1洗脱,即得。 |