一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法

摘要

本发明提供了一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法，包括如下操作步骤：a.标准曲线制作，b.样品的采集与制备，c.样品浓缩，d.样品培养，e.终止酶反应，f.吸光度分析。本发明的方法补充了PPCPs研究过程中酶测定方法的缺失，它的检测结果稳定，具有较高的实用价值，同时可用作其他降解菌酶活性的测定，利于推广应用。

主权项

一种碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性测定方法，其特征在于，具体步骤为：步骤a.标准曲线制作：准确称量0.3g碘普罗胺标准品加入100mL蒸馏水中，配成3g/L的碘普罗胺溶液，逐级稀释到3、6、9、12、15、18、24mg/L，在242nm波长下测其吸光度，绘制标准曲线；步骤b.样品的采集与制备：配制含有30mg/L碘普罗胺、1g/L可溶性淀粉的100mL无机盐培养基，将本实验室分离得到的假单胞菌以10wt％的接种量接种到所述的无机盐培养基中，将其置于30℃摇床中在180r/min条件下避光振荡培养，1d后菌种生长量达到较为活跃的对数期，所得菌液即可作为待测样品；步骤c.样品浓缩：将上步所得的待测样品取40mL装入50mL离心管内，以8000rpm的速度离心30min，弃去上清液，加入4mL pH7.1的Tris‑HCl缓冲液清洗菌体，再以8000rpm的速度离心30min，弃去上清液，重复清洗一次，以20～30mL Tris‑HCl缓冲液混匀沉淀物，放入超声波细胞破碎机中冰浴破碎30min，功率300W，工作2s，休息1s，所获溶液即为粗酶液；步骤d.样品培养：向6只10mL具塞试管中分别加入3mL pH7.1的Tris‑HCl缓冲液、1mL 15mg/L的碘普罗胺溶液以及1mL粗酶液，混合均匀后将3只试管作为样品管置于30℃恒温水浴锅培养2小时，另外3只作为空白对照管在80～90℃水浴放置10min灭活；步骤e.终止酶反应：将样品管在80～90℃水浴中放置10min灭活，将样品管和空白对照管分别倒入10mL离心管中，以12000rpm离心20min；步骤f.吸光度分析：将步骤e中离心后的上清液倒入1cm石英比色皿中，使用紫外‑可见光分光光度计在242nm波长下测定吸光度，计算空白对照管与样品管的吸光度之差，比对碘普罗胺标准曲线，计算碘普罗胺降解菌产生的碘普罗胺酶的活性，取三组数据的平均值。碘普罗胺酶的活性单位定义为每分钟降解1μmol碘普罗胺所需要的酶量。