排除错误信号的靶核酸序列的实时多路检测

摘要

本发明涉及一种排除错误信号的靶核酸序列的实时多路检测。与以往实时多重PCR方法不同地，本发明在互不相同的反应容器包含两个不同的扩增反应。即为用于获取扩增子的第一次多重PCR及利用上述扩增子的第二次套式实时多重PCR。本发明用于排除由于形成标记引物的二聚物而产生的假阳性信号、基于非特异性杂交的假阳性信号以及假阴性信号。

主权项

一种在实时多重PCR排除错误信号的试样内至少三种的靶核酸序列的实时多路检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（a），在反应容器实施用于扩增上述靶核酸序列的第一次多重PCR，为了在上述试样中获取上述靶核酸序列的扩增子，在能够扩增至少三种的靶核酸序列的条件下，利用至少三种的一对引物及模板‑依赖性核酸聚合酶来实施上述第一次多重PCR；步骤（b），在与上述步骤（a）中所使用的反应容器不同的反应容器准备第二次套式实时多重PCR反应混合物，上述第二次套式实时多重PCR反应混合物包含：（i）在上述步骤（a）中获取的扩增子，（ii）用于上述扩增子的第二次套式实时多重PCR的至少三种的一对引物，在上述至少三种的各个一对引物中，至少一个引物是与相关扩增子的内部序列杂交的套式引物，以及（iii）模板‑依赖性核酸聚合酶，上述至少三种的各个一对引物包含至少一个套式引物，上述至少一个套式引物具有在上述第二次套式实时多重PCR期间产生用于表示靶核酸序列的存在的信号的标记；步骤（c），利用上述步骤（b）的上述反应混合物，并通过至少2循环来实施引物退火、引物延长及变性，由此实施上述第二次套式实时多重PCR，用于表示上述靶核酸序列的存在的上述信号在循环期间从上述各个标记引物中产生，上述第二次套式实时多重PCR能够以产生用于表示靶核酸序列的信号，而不产生错误信号的循环数来实施；以及步骤（d），检测用于表示靶核酸序列的存在的信号，上述检测在步骤（c）的上述反复的各循环中，在步骤（c）的上述反复的终点或者步骤（c）的上述反复期间的各个预定时间间隔内实施，据此表示上述靶核酸序列的上述信号通过实时方式得到获取，且不产生错误信号。