一步层析法从大肠杆菌中纯化Exendin-4的工艺

摘要

一步层析法从大肠杆菌中纯化Exendin-4的工艺，它是按下述步骤进行的：(1)菌体裂解、(2)重组Exendin-4吸附、(3)杂蛋白漂洗、(4)树脂平衡、(5)融合端切除及Exendin-4收集、(6)Exendin-4纯度及活性鉴定。由于本发明对蛋白质纯化步骤进行了革新，对相应的裂解液、洗液及平衡液的配方和用量进行了改进，省去了洗脱、透析及再次层析等步骤，增加了目的蛋白的产量和纯度。本发明和现有技术相比，简化了操作程序，操作步骤简便易行，适合工业化大批生产。

主权项

一步层析法从大肠杆菌中纯化Exendin‑4的工艺，其特征在于它是按下述步骤进行的：(1)菌体裂解：将‑20℃保存的含重组Exendin‑4的细菌于冰上融化后，每克细菌用10ml裂解缓冲液悬浮沉淀，冰浴30min，超声波破碎；(2)重组Exendin‑4吸附：将上述裂解缓冲液于4℃，8000rpm离心30min；将上清液与镍树脂按2∶1体积混合，4℃缓慢振荡吸附3h；4℃，3000rpm离心5min，弃去上清；(3)杂蛋白漂洗：在上述镍树脂中加入4.0倍于裂解缓冲液的漂洗缓冲液，4℃缓慢振荡5min，3000rpm离心5min，弃上清；(4)树脂平衡：在上述镍树脂中加入2.5倍于裂解缓冲液的平衡缓冲液，4℃缓慢振荡20min；4℃，3000rpm离心5min，弃上清；再重复一次；(5)融合端切除及Exendin‑4收集：用与裂解缓冲液等体积的平衡缓冲液悬浮树脂，加入10U肠激酶，4℃缓慢摇动消化6h；静置30min后，3000rpm离心5min，上清液即纯化的Exendin‑4溶液；(6)Exendin‑4纯度及活性鉴定：利用Ticin‑SDS‑PAGE鉴定Exendin‑4的纯度，用糖尿病小鼠鉴定Exendin‑4的生物活性；所述步骤(1)中所用裂解缓冲液的组成为：50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑，用NaOH调pH至8.0；现用现加：Trition 100，0.01％；甘油，2％；β‑巯基乙醇，10mM；PMSF，0.1％；1mM MgCl2；1mM MnCl2，；Rnase1U；Dnase 1U；所述步骤(3)中所用的漂洗缓冲液组成为：50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑，用NaOH调pH至8.0；现用现加：甘油，2％；β‑巯基乙醇，10mM；所述步骤(4)和步骤(5)中所用的平衡缓冲液的组成为50mM Tris‑HCl；1mM CaCl2；0.1％Tween 20，pH8.0。