一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法

摘要

本发明公开了一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列为抗玉米粗缩病的目的基因序列，通过四次PCR反应，获得目的基因序列，经限制性内切酶酶切、分离、回收、连接，构建植物表达载体；将植物表达载体利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。该方法利用RNA干扰技术，可培育出优良的抗粗缩病的玉米转基因植株，从根本上解决玉米粗缩病问题，显著提高玉米产量，提高其经济价值。

主权项

1.一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，其特征在于：以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以下述四对引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增，下一对引物上下游的3’端分别与上一对引物上下游的5’端有部分碱基重叠，第一对引物以F0为模板，以后每一对引物以上一对引物的产物为模板，这样每次PCR之后都在5’和3’端将目的序列延伸，最终扩增得到目的基因序列；四对引物分别如下： f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pSK-int，于1.0％ 琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pSK-int载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303；用不同的两种限制性内切酶分别酶切中间载体pSK-int-FR303和植物表达载体pJIM19，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pJIM19载体中，即为构建成功的植物表达载体pJIM19-MRDV303；将植物表达载体pJIM19-MRDV303利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株；其中，含正向序列的中间载体pSK-int-F303通过如下步骤构建，1）PCR扩增获得正向片段：以上述步骤A 6）得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F₁和R₁，其5’端分别引入限制性内切酶位点XhoI和HindIII，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全；引物序列如下：F₁：5’ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’，R₁：5’CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’；PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1-10ng，dNTPs 100μmol/L，上游引物F1 5 pmol，下游引物R1 5 pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg²⁺ 1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；PCR反应程序为：先94℃ 4 min；再94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30次；最后72℃延伸5 min；将扩增得到的产物在1% 琼脂糖凝胶上电泳分离，得到正向片段PCR产物；2）PCR产物与中间载体的酶切、回收和纯化：PCR产物30μL酶切体系为：10×H缓冲液3.0μL，正向片段PCR产物    10.0μL，XhoI 5 U，HindⅢ 5 U，ddH₂O加至终体积30μL；中间载体20μL酶切体系为：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int中间载体5.0μL，XhoI 5 U，HindⅢ 5 U，ddH₂O加至终体积20μL；37℃温育4小时，将得到的酶切产物在1.0%琼脂糖凝胶上分离，再回收和纯化，得到纯化的回收产物；3）正向片段连入中间载体：回收产物连接到中间载体pSK-int10μL反应体系为：pSK-int中间载体2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶350 U，回收正向片段酶切产物5μL，ddH₂O加至终反应体积10μL；16 ℃连接10 h；转化大肠杆菌DH5α，方法同前述步骤A 5）;4）正向片段阳性克隆的筛选：挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225 r/min振荡培养12 h；取培养后的菌液进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCR缓冲液        2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₁ 5 pmol，引物R₁ 5 pmol，Taq DNA聚合酶1 U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；PCR扩增程序同上述步骤B 1）;对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的样品用于下一步载体构建，命名为pSK-int-F303；反向重复序列的中间载体pSK-int-FR303通过如下步骤构建，1）PCR扩增获得反向片段：以上述步骤A 6）得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F₂和R₂，其5’端分别引入限制性内切酶位点SpeI和PstI，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全;引物序列如下：F₂：5’AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’，R₂：5’AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’；PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1-10 ng， dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5 pmol，引物R₂ 5 pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；PCR扩增程序同上述步骤B 1）;2）反向片段PCR产物与载体pSK-int-F303的酶切：PCR产物30μL酶切体系：10×H缓冲液3.0μL，反向片段PCR产物10.0μL，SpeI 5 U，PstI 5 U，ddH₂O加至终体积30μL；中间载体20μL酶切体系：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int-F303中间载体5.0μL，SpeI 5 U，PstI 5 U，ddH₂O加至终体积20μL；37℃温育4小时；酶切产物的回收、纯化、连接和转化等操作与正向片段的相同；10μL连接体系为：pSK-int-F303中间载体2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶350 U，回收反向片段酶切产物5μL，ddH₂O加至终反应体积10μL；16 ℃连接12 h；3）反向片段阳性克隆的筛选：挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225 r/min振荡培养12 h；取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5 pmol，引物R₂ 5 pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；PCR扩增程序同上述步骤B 1）;对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303；表达载体pJIM19-MRDV303通过如下步骤构建，1）XhoI和SpeI双酶切含反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR30330μL酶切体系为：10×K缓冲液1.5μL，pSK-int-FR303 15.0μL，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL；37℃温育30分钟；2）XhoI和SpeI双酶切植物表达载体pJIM1930μL酶切体系如下：10×K缓冲液3.0μL，pJIM1910.0μL，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL；37℃温育2小时；3）酶切产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体的大片段，所有操作按说明书进行;T4 DNA 连接酶连接；10μL连接体系为：10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列                      5μL，植物表达载体的大片段2μL，T4 DNA连接酶 350 U，ddH₂O加至终反应体积10 μL；16℃连接10 h；4）阳性克隆的筛选挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃、225 r/min振荡培养12小时；取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5 pmol，引物R₂ 5 pmol，Taq DNA聚合酶1 U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；PCR扩增程序同上述步骤B 1）;PCR呈阳性的克隆在20 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒；XhoI和SpeI双酶切鉴定，0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建好的植物表达载体，在本发明中命名为pJIM19-MRDV303。