通过大肠杆菌发酵大规模生产质粒DNA的方法

摘要

本发明总体上涉及增加质粒DNA生产的产量的方法。该方法包括下述步骤：选择携带DNA质粒的大肠杆菌菌株(包括但不限于DH5菌株)的高产克隆亚型，并在化学成分确定的培养基中，通过补料分批发酵培养所述克隆亚型。当以工业规模培养所述高产克隆亚型时，本文所述的质粒DNA生产方法可以产生最高记录量的质粒DNA。公开的方法可以用于生产药物级DNA，以用于多核苷酸疫苗接种和基因治疗治疗方案中。

主权项

生产质粒DNA的方法，其包含：(a)选择用DNA质粒转化的大肠杆菌菌株的高产克隆亚型，其包含：(i)观察由所述转化的大肠杆菌产生的菌落群体的表型不均匀性，并且选择那些代表着所述菌落群体中所述表型不均匀性的一小部分的菌落作为潜在高产克隆亚型；(ii)纯化所述潜在高产克隆亚型并通过测量每个细胞的质粒拷贝数测定所述纯化的、潜在高产克隆亚型的生产力；和(iii)选择与相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌克隆亚型相比，表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数的潜在高产克隆亚型作为高产克隆亚型；和，(b)在化学成分确定的培养基中，通过补料分批发酵，以大于约1000L的发酵体积培养所述高产克隆亚型，其中在所述转化的大肠杆菌在约30℃下在血琼脂上生长之后观察所述表型不均匀性，并且其中代表着所述表型不均匀性的一小部分的潜在高产克隆亚型是灰色菌落，而所述表型不均匀性的主要部分是白色菌落，并且其中所述大肠杆菌菌株是DH5.