培育根癌农杆菌介导的长春花转基因植株的方法

摘要

一种生物技术领域的培育根癌农杆菌介导的长春花转基因植株的方法，包括如下步骤：取长春花无菌苗，获取无菌苗的下胚轴；制备根癌农杆菌菌液，利用根癌农杆菌介导长春花下胚轴的转化；取下胚轴，置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得愈伤组织；将愈伤组织接种到分化培养基上进行培养，得绿色愈伤组织；将绿色愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上进行培养，得不定芽；取不定芽，置入生根培养基中进行培养，得长春花转基因植株。本发明建立了稳定的根癌农杆菌介导的长春花遗传转化体系，为进一步研究代谢途径调控网络和提高TIAs的含量奠定了基础，能进一步应用到生产TIAs代谢产物的基因工程育种中。

主权项

一种培育根癌农杆菌介导的长春花转基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，取长春花无菌苗，获取无菌苗的下胚轴；步骤二，制备根癌农杆菌菌液，利用根癌农杆菌介导长春花下胚轴的转化；步骤三，取下胚轴，置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得到愈伤组织；步骤四，将愈伤组织接种到分化培养基上进行培养，得绿色愈伤组织；步骤五，将绿色愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上进行培养，得不定芽；步骤六，取不定芽，置入生根培养基中进行培养，得长春花转基因植株；步骤二中，所述制备根癌农杆菌菌液具体为：取携带pCAMBIA2300‑GUS表达载体的根癌农杆菌，在添加100mg/L卡那霉素、100mg/L利福平和40mg/L链霉素的固体LB培养基进行培养，培养pH为7.0；挑取单菌落接种到添加100mg/L卡那霉素、100mg/L利福平和40mg/L链霉素的LB液体培养基中，培养基的pH为7.0，培养至对数期，菌液浓度OD600值为0.8；将菌液以转速5,000rpm/min离心8min，然后用含100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基稀释至OD600值为0.4，28℃下100rpm/min摇床振荡培养2h，得菌液；步骤二中，所述转化具体为：将长春花的下胚轴放入无菌的EP管中，加入含100μmol/L的乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基将其悬浮，超声波处理80W，处理10min，之后将下胚轴浸入OD600为0.4的根癌农杆菌菌液中，100rpm摇床震荡培养，30min后弃去菌液，用无菌滤纸将表面菌液吸干；将下胚轴平铺于添加100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS培养基上，在26℃遮光的恒温培养箱中共培养2d；步骤三中，所述愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+0.1mg/L 2，4‑二氯苯氧乙酸+0.1mg/L α‑萘乙酸+头孢霉素500mg/L+卡那霉素40mg/L+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8；步骤四中，所述分化培养基为：MS培养基+2.5mg/L 6‑苄基腺嘌呤+0.25mg/L α‑萘乙酸+头孢霉素500mg/L+70mg/L卡那霉素+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8；步骤五中，所述不定芽诱导培养为：MS培养基+1mg/L 6‑苄基腺嘌呤+0.1mg/L 3‑吲哚乙酸+头孢霉素500mg/L+卡那霉素90mg/L+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8；步骤六中，所述生根培养基为：1/2MS培养基+头孢霉素500mg/L+0.3mg/L α‑萘乙酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8。