一种重组农杆菌质粒快速鉴定方法

摘要

本发明涉及一种农杆菌的鉴定方法，具体的说是一种重组农杆菌质粒快速鉴定方法，可以直接应用于科学研究领域。该鉴定方法包括以下步骤：将质粒通过热激法或电击转化法转入农杆菌，经过携带抗生素的固体培养基的涂布培养得到单菌落，挑取单菌落，摇瓶培养，至OD600=1.0-1.2之间，离心，收集菌体，加悬浮液，混匀，加溶菌酶，煮沸1-3min,离心，琼脂糖凝胶电泳法对重组质粒和空载进行区分，PCR检测，鉴别阳性克隆。

主权项

一种重组农杆菌质粒快速鉴定方法，其特征在于：该重组农杆菌质粒快速鉴定方法包括以下步骤：（1）、将质粒pCAMBIA1302转化进入发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株后；通过涂布培养的方法，在超净工作台中，将转化后的菌液涂布在携带kan抗性的固体LB培养基的培养皿上，将培养皿用封口膜封好，保证无菌条件，将培养皿放在26.5℃，黑暗条件下培养1‑2天；（2）、定时观察涂布培养后培养皿中的菌落生长情况，待转化后菌落生长到2‑3mm时,挑取独立生长的菌落进行摇瓶培养；（3）、取50ml的三角烧瓶，加入10ml的LB液体培养基和10ul的kan抗生素，用牙签挑取1个独立生长的菌落加入到三角瓶中，在恒温振荡摇床中，26.5℃，160r/min，摇瓶培养过夜；（4）、取出摇瓶，取用1ml菌液，用分光光度计在波长为600nm时测定菌液的OD值，当菌液的OD600为1.0‑1.2时，进行重组质粒的提取和鉴定；（5）、 在超净工作台中，用移液器取1.5ml菌液加入1.5ml Eppendoff管中；（6）、在高速冷冻离心机中，4℃，12000r/min，离心2min；（7）、离心之后，将1.5ml Eppendoff管取出，倒去上清液,将1.5ml Eppendoff管倒扣在无菌滤纸上吸干1.5ml Eppendoff管中的残留液体；（8）、向1.5ml Eppendoff管加入10ul悬浮液（葡萄糖50mmol/L；Tris‑Hcl(PH8.0)25mmol/L; RNaSeA 0.2mg/ml）用移液器反复抽吸混匀,并用涡轮混合仪充分混匀；（9）、向步骤（8）的1.5ml Eppendoff管中加入5ul溶菌酶（5mg/ml）, 用移液器反复抽吸混匀；（10）、将步骤（9）的1.5ml Eppendoff管在室温条件下，放置3min；（11）、将步骤（10）的1.5ml Eppendoff管放入沸水中2min后取出；（12）、将步骤（11）的1.5ml Eppendoff管在高速冷冻离心机中，4℃，12000r/min，离心2min；（13）、将离心之后的上清液取出，存于0.2ml的Eppendoff管中；（14）、利用琼脂糖凝胶电泳法对重组的发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒和未经过转化的原种发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒进行区分；（15）、将步骤（14）中鉴定成功的重组发根农杆菌A4菌株或15834菌株或根癌农杆菌GV3101菌株中的质粒进行PCR检测，准确地鉴别阳性克隆。