大肠杆菌O157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条

摘要

本发明涉及一种大肠杆菌O157:H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条，属于抗体检测试剂盒技术领域。由颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG制成胶体金垫、分别用大肠杆菌O157:H7抗原和纯化的鼠血清IgG包被的硝酸纤维素膜作为检测线和质控线、玻璃纤维素膜制成的样品吸收垫、吸水滤纸制成的吸收垫组装成的检测试纸条、阳性血清、阴性血清、血清样品稀释液和试纸条使用说明书组成。该试纸条使用简便、快速、敏感，10分钟内即可获得检测结果，适用于在动物养殖场、食品生产企业等地区调查与追溯鼠O157:H7感染状况时的现场检测以及在开展食品安全环境风险评估时使用。

主权项

一种大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)O157：H7鼠血清抗体胶体金免疫层析检测试纸条，是由颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG制成胶体金垫、分别用O157：H7抗原和纯化的鼠血清IgG包被的硝酸纤维素膜作为检测线和质控线、玻璃纤维素膜制成的样品吸收垫、吸水滤纸制成的吸收垫组装成的检测试纸条，其制备方法为：1)大肠杆菌O157：H7抗原的制备培养大肠杆菌O157：H7，3500r/min离心30min，用PBS重悬，0.5％甲醛灭活，PBS洗3次，沉淀重悬于PBS，‑20℃冻存备用；2)免疫胶体金的制备取20nmpH值为7.0的颗粒胶体金溶液，加入蛋白量为27.5μg/ml的已纯化羊抗鼠IgG，在室温下搅拌30min，加质量体积比10％牛血清白蛋白BSA使其终浓度为质量体积比0.4％，室温搅拌5min，加质量体积比10％PEG使PEG终浓度为质量体积比0.2％，室温搅拌5min；12000r/min离心45min，吸取离心上清，沉淀溶于2ml保存液中，用0.45μm滤膜过滤，置4℃保存备用，制得胶体金标记抗体原液；保存液配制方法：0.1g四硼酸钠、0.25g BSA、0.025g NaN3加水溶解后用6N HCl调pH至7.4，补水至250ml，用0.45μm滤膜过滤后，4℃保存；3)金标抗体玻璃纤维素膜的制备取胶体金标记抗体原液1ml，加入工作液2ml稀释，混匀，均匀地加在玻璃纤维素膜上，制成金标抗体玻璃纤维素膜，即胶体金垫，37℃干燥，4℃保存备用；工作液配制方法：6.1g Na2HPO4.12H2O、8.5g NaCl、5.0g PVP40、2.1g硼酸、1.0g PEG4000、0.5g BSA加水溶解后用6N HCl调pH至7.4，补水至1000ml，用0.45μm滤膜过滤后，4℃保存；4)固相硝酸纤维素膜NC的制备用0.01M pH7.2的PBS分别稀释大肠杆菌O157：H7抗原和纯化的鼠血清IgG，用蛋白浓度为2.0mg/ml大肠杆菌O157：H7抗原和蛋白浓度为2.0mg/ml纯化鼠血清IgG点样于NC膜上分别作为检测线和质控线，室温干燥，封闭，层析试验背景清晰；5)试纸条的组装在宽2×长9cmPVC底板上(1)，中间段粘贴宽2×长3cm固相硝酸纤维素膜，即NC膜(2)；靠近固相纤维素膜检测线T线一端的PVC底板表面粘贴2×2cm的胶体金‑羊抗鼠IgG抗体结合物玻璃纤维膜(5)，此玻璃纤维素膜与NC膜(2)重叠0.1cm，另一端与2×1cm的样品吸收垫(7)重叠0.2cm；靠近固相纤维素膜质控线C线一端的PVC底板表面黏贴2×3.5cm的吸水滤纸制成的吸收垫(6)，与NC膜重叠0.1cm；抗体固相硝酸纤维素膜NC膜(2)上划有一条大肠杆菌O157：H7抗原检测线T线(3) 和一条鼠血清IgG质控线C线(4)；T线划在长3cm×宽2cm NC膜一侧1cm的位置上，将浓度为2.0mg/mL的大肠杆菌O157：H7抗原装入划膜机，喷涂于NC膜上，另一喷头划质控线C线，浓度为2.0mg/mL的鼠血清IgG，C线划在NC膜另一侧1cm的位置上，检测线与质控线的距离为1cm，点样量均为5μl喷在硝酸纤维膜上，组装好的纸板按纵向剪切，裁成宽度为2.5mm的条状，即为抗体检测试纸条成品。