一种产角质酶基因工程菌及其应用

摘要

本发明公开了一种产角质酶基因工程菌及其应用，属于生物工程技术领域。构建重组质粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，并转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，得到重组大肠杆菌Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/E.coliBL21(DE3)。采用补料分批发酵的方式控制一定的比生长速率，发酵培养30-34h，发酵上清酶活达到700-750U/mL。本发明以甘油为主要原料，采用半合成培养基，具有稳定性好，便于调控等优点，适于大规模生产。

主权项

一种应用基因工程菌生产角质酶的方法，包括如下步骤：1）发酵过程温度维持在36‑38℃，通过增减搅拌转速或通入富氧空气使溶解氧维持20‑40 %，通过补加氨水控制生长阶段pH 7.0‑7.2、诱导产酶阶段pH 6.4‑6.6；2）发酵5‑6 h或溶解氧浓度升至> 70%时，以初始3.5‑5.0 mL·L‑1·h‑1的流速补加500g/L的甘油，以后通过指数补料方式流加甘油控制菌体比生长速率在0.15‑0.3 h‑1之间；3）发酵12‑13 h或OD600达到25‑35时，加入终浓度0.02‑0.04 mM/L IPTG进行诱导，同时以8‑10 mL·L‑1·h‑1的速度补加50g/L的乳糖，停止补加氨水，待pH 降至6.4‑6.6后通过补加氨水控制pH 6.4‑6.6；4）发酵15‑17 h或诱导3‑4 h，甘油流速恒定，25‑35 mL·L‑1·h‑1；5）发酵19‑21 h或OD600不再增加时，将乳糖流速降至2‑4 mL·L‑1·h ‑1，甘油流速6‑8 h内逐步下降至12.5‑17.5 mL·L‑1·h‑1；所述基因工程菌构建方法如下：1）以质粒Tfu_0883 /pET20b(+)为模板扩增角质酶Tfu_0883基因；2）以E. coli  CFT073总DNA为模 板扩增hlyAs的基因；3）以Tfu_0883基因和hlyAs基因PCR割胶回收片断为模板， PCR扩增得到Tfu_0883‑hlyAs基因；4）pET20b(+)和Tfu_0883‑hlyAs进行双酶切，割胶产物回收转化E. coli  JM109感受态细胞，构建质粒Tfu_0883‑hlyAs/pET20b(+)；5）重组质粒Tfu_0883‑hlyAs/pET20b(+)转化大肠杆菌E. coli  BL21(DE3)，得到大肠杆菌Tfu_0883‑hlyAs/pET20b(+)/E. coli BL21(DE3)。