一种霍山石斛体细胞胚发生的方法

摘要

本发明涉及一种霍山石斛体细胞胚发生的方法。该方法包括以下操作步骤：（1）无菌试管苗的诱导；（2）胚性愈伤组织的诱导；（3）体细胞胚的诱导；（4）体细胞胚的同步化增殖，得到大量霍山石斛体细胞胚。本发明通过取无菌试管苗的带节的茎段的形态学下端为外殖体，并控制诱导培养基的氧化还原电位，而不需要添加外源激素诱导获得霍山石斛胚性愈伤组织，避免了外源激素通过体细胞胚富集到完整植株中而危害人体健康。通过控制环境湿度使胚性愈伤组织发生为体细胞胚，达到球形体细胞胚一致性90%以上，再生植株存活率85%以上。本发明操作工艺简单，不受时间、季节限制，可在室内工厂自动化生产霍山石斛体细胞胚及试管苗以供生产栽培的需要。

主权项

一种霍山石斛体细胞胚发生的方法，其特征在于包括以下操作步骤：（1）无菌试管苗的诱导取霍山石斛成熟果实，先用质量分数为1%的次氯酸钠水溶液进行表面消毒60min，再用无菌双蒸馏水冲洗3～5次，然后切开果实，取出种子，并将种子撒在固体MS培养基上，于温度22±2℃、光照强度2000～3000勒克斯、每天光照12小时的条件下培养6～7个月，获得4‑6cm长的霍山石斛无菌试管苗；（2）胚性愈伤组织的诱导取无菌试管苗的带节的茎段的形态学下端，插入氧化还原电位为‑0.03～‑0.02伏的固体诱导培养基中，于温度22±2℃、黑暗中诱导培养20～25天，得胚性愈伤组织；所述固体诱导培养基是在固体MS培养基的基础上加入质量分数为50～100mg/L的磷酸钠；（3）体细胞胚的诱导将胚性愈伤组织转移到固体MS培养基中，在相对湿度为70～85%、温度22±2℃、光照强度2000～3000勒克斯、每天光照12小时的条件下诱导培养3周后，转接到固体MS培养基中，在相对湿度为70～85%、温度22±2℃、光照强度2000～3000勒克斯、每天光照12小时的条件下诱导培养3周；按本步骤的诱导操作条件连续转接10～15次，转接培养基为固体MS培养基，得体细胞胚；（4）体细胞胚的同步化增殖将体细胞胚转移到液体MS培养基或固体MS培养基中，在温度22±2℃、光照强度2000～3000勒克斯、每天光照12小时的条件下，采用过筛法或饥饿法同步化增殖培养，得霍山石斛体细胞胚；所述过筛法按如下步骤操作：将液体培养25天的体细胞胚先通过10目筛，收集透过的体细胞胚继续培养5天后再通过20目筛，收集截留的体细胞胚；所述饥饿法按如下步骤操作：将体细胞胚在新鲜MS培养基中培养25天后，用无菌的10目筛过滤，透过的体细胞胚再用20目筛过滤，将截留的体细胞胚转移到无铁盐的MS培养中饥饿培养2天后，转入新鲜的MS培养基中继续培养5天。