甲型H1N1流感病毒的环介导等温扩增检测方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种采用环介导恒温核酸扩增(LAMP)技术对甲型H1N1流感病毒进行检测的方法。该检测方法包括：病毒RNA提取；逆转录及LAMP扩增；LAMP扩增产物单链化；采用核酸纳米金生物传感器对LAMP扩增产物的检测。本发明还提供了用于检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒。本发明利用经特殊设计的LAMP内引物通过LAMP扩增过程将一段酶切位点序列引入到扩增产物中，然后使用限制性内切酶TspR I消化扩增产物并通过物理骤冷的办法获得大量长度为140bp左右的单链DNA产物，由于采用了特定引物的环介导恒温核酸扩增技术并结合含有特定探针的核酸纳米金生物传感器，使得所述的检测方法和试剂盒特异性高、检测迅速。

主权项

一种用于检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于，包括：环介导恒温核酸扩增反应试剂，其包含：    10倍环介导恒温核酸缓冲液、镁离子、酶混合液、限制性内切酶TspRⅠ、RNA酶抑制剂、上游外引物、上游内引物、下游外引物、下游内引物；其中，上游外引物是如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，上游内引物是如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，下游外引物是如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，下游内引物是如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述酶混合液是由Bst酶8U/µl和逆转录酶5U/µl以体积比1：1混合组成；以及核酸纳米金生物传感器；所述的核酸纳米金生物传感器，包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的，该寡核苷酸探针是如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；所述硝酸纤维素膜上固定有两种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针是用生物素标记并与链霉亲和素偶联形成的；固定于靠近吸水纸一端的寡核苷酸探针形成质控线，该寡核苷酸探针是如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；固定于靠近玻璃纤维一端的寡核苷酸探针形成检测线，该寡核苷酸探针是如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的核酸纳米金生物传感器中，质控线与检测线相距3‑10mm；所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠1‑5mm；所述胶体金的粒径为8‑100nm。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述用于环介导恒温核酸扩增反应的外引物与内引物之间的浓度比为1 : 1~1 : 10。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述用于环介导恒温核酸扩增反应的外引物与内引物之间的浓度比为1 : 4。5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述用于环介导恒温核酸扩增反应的上游内引物和下游内引物的序列中都含有一段9nt限制性内切酶TspRⅠ酶切位点序列，其中，上游内引物中的酶切位点序列是5‑GACACTGGA‑3，下游内引物中的酶切位点序列是5‑GACACTGTC‑3。