瘦肉型淮猪品系生长性状多基因聚合育种方法

摘要

本发明涉及瘦肉型淮猪品系生长性状多基因聚合育种方法。该方法包括以下操作步骤1、猪的基因组DNA提取；2、引物设计：根据胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、垂体特异性转录因子-I(PIT-I)、肝X受体α(LXRα)和黑皮质素受体-4(MC4R)基因序列设计聚合酶链式反应(PCR)扩增引物；3、聚合酶链式反应(PCR)；4、限制性内切酶酶切反应(RFLP)；5、各基因多态性与生长性状相关分析。确定聚合基因型为AADDGGFF的个体生长速度最快，在选择留种后，其他后代不会产生基因分离现象，使后代的生长性能在四个基因型效应上具有最佳效果，而且稳定遗传，使生长性能基因在1个世代内即可达到纯合，加速瘦肉型淮猪快生长品系的培育。

主权项

瘦肉型淮猪品系生长速度多基因聚合育种方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)、猪的基因组DNA提取在仔猪出生当天，取猪的耳缘组织，从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA；(2)、引物设计根据胰岛素样生长因子‑I、垂体特异性转录因子‑I、肝X受体α和黑皮质素受体‑4基因序列设计聚合酶链式反应扩增引物如下表，胰岛素样生长因子‑I扩增片段长度为179bp，扩增片段位于胰岛素样生长因子‑I基因编码序列的374bp至552bp，突变位点位于扩增片段的第116bp处；垂体特异性转录因子‑I基因扩增片段长度为638bp，扩增片段位于垂体特异性转录因子‑I基因从第5外显子第4bp至第6外显子第5bp处，突变位点位于垂体特异性转录因子‑I基因第5内含子第262bp处，即扩增片段的第322bp处；肝X受体α基因扩增片段长度为173bp，扩增片段位于从第2外显子38bp至第2内含子的第33bp处，突变位点位于肝X受体α基因第2外显子处的第155bp处，即扩增片段的第117bp处；黑皮质素受体‑4基因扩增片段长度为226bp，扩增片段位从黑皮质素受体‑4基因序列的1269bp至1494bp处，突变位点位于黑皮质素受体‑4基因1424bp处，即扩增片段的第156bp处； 基因  上游引物 下游引物 IGF‑I  5’‑AGCCCACAGGGT ACG GCT C‑3’ 5’‑CTTCTAGGAGCCTTGGGCAT‑3’ PIT‑I  5’‑ATACAATGAGAAAGTGGGAGC‑3’ 5’‑CAATACTGGGAGGTGAGATGG‑3’ LXRα  5’‑AGTCTCTGGGAAGCTCCAG‑3’ 5’‑CCCTACCTCCTCCAAAGGC‑3’ MC4R  5’‑TACGTGACCATATTGATTG‑3’ 5’‑ATAACAGATGATCTCTTATG‑3’(3)、聚合酶链式反应(PCR)分别制备胰岛素样生长因子‑I的聚合酶链式反应体系25μl、垂体特异性转录因子‑I的聚合酶链式反应体系25μl、肝X受体α的聚合酶链式反应体系25μl和黑皮质素受体‑4基因的聚合酶链式反应体系25μl；每个聚合酶链式反应体系包括浓度为2.5mmol/l的脱氧核苷三磷酸2μl，四种聚合酶链式反应体系每种体系分别单独加入上表中相对应基因的浓度为10mmol/ml的上游引物和浓度为10mmol/ml的下游引物各0.5μl，浓度为10U/μl聚合酶Taq0.4μl，浓度为50ng/ul的DNA基因组模板2μl，含氯化镁浓度为20mmol/l的10×聚合酶链式反应缓冲液2μl，加水至终体积25μl，并混合均匀；聚合酶链式反应条件如下：将上述胰岛素样生长因子‑I的聚合酶链式反应体系、垂体特异性转录因子‑I的聚合酶链式反应体系、肝X受体α的聚合酶链式反应体系和黑皮质素受体‑4基因的聚合酶链式反应体系分别在以下条件下反应：①温度94℃预变性5分钟；②温度94℃变性：胰岛素样生长因子‑I为30秒、垂体特异性转录因子‑I为35秒、肝X受体α为30秒、黑皮质素受体‑4为30秒；③退火温度：胰岛素样生长因子‑I为58℃30秒、垂体特异性转录因子‑I为61℃35秒、肝X受体α为58℃30秒、黑皮质素受体‑4为58℃30秒；④温度72℃延伸：胰岛素样生长因子‑I为30秒、垂体特异性转录因子‑I(PIT‑I)为35秒、肝X受体α为30秒、黑皮质素受体‑4为30秒；⑤重复第②～④步骤30个循环；⑥温度72℃延伸7分钟，最后降温至4℃保存；得到四种基因的聚合酶链式反应扩增产物，即胰岛素样生长因子‑I基因的PCR扩增产物、垂体特异性转录因子‑I基因的PCR扩增产物、肝X受体α基因的PCR扩增产物和黑皮质素受体‑4基因的PCR扩增产物；其中胰岛素样生长因子‑I基因扩增片段长度为179bp；垂体特异性转录因子‑I基因扩增片段长度为638bp；肝X受体α基因扩增片段长度为173bp；黑皮质素受体‑4基因扩增片段长度为226bp；(4)、限制性内切酶酶切反应取胰岛素样生长因子‑I基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/μl的限制性内切酶Hha I0.5μl，限制性内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，并混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，胰岛素样生长因子‑I基因的扩增产物具有2个酶切位点，其中1个酶切位点，即第4外显子处116bp位点有一多态，产生2个等位基因：其中116bp处无切点的为等位基因A151bp+28bp，116bp处切开的为B等位基因116bp+35bp+28bp；含有151bp+28bp条带的命名为AA型；含有151bp+28bp+116bp+35bp条带的命名为AB型；含有116bp+35bp+28bp条带的命名为BB型；取垂体特异性转录因子‑I基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/μl的限制性内切酶RsaI0.5μl，限制性内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，垂体特异性转录因子‑I基因扩增产物具有2个酶切位点，产生2个等位基因：其中322bp处切不开的为D等位基因469bp+168bp，322bp处可切开的为E等位基因322bp+147bp+168bp；含有469bp+168bp两条带的命名为DD型；含有469bp+322bp+147bp+168bp条带的命名为DE型；含有322bp+147bp+168bp条带的命名为EE型；取肝X受体α基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/ul限制性内切酶Bsl I0.5ul，内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，肝X受体α基因扩增产物具有2个酶切位点，其中1个位点被切开，该位点位于117bp处，产生2个等位基因：其中117bp处切不开的为C等位基因141bp+32bp， 117bp可以切开的为G等位基因117bp+32bp+24bp；含有141bp+32bp条带的命名为CC型；含有141bp+117bp+32bp+24bp条带的命名为CG型；含有117bp+32bp+24bp条带的命名为GG型；取黑皮质素受体‑4基因的PCR扩增产物10ul于聚合酶链式反应管中，加入浓度为10U/ul限制性内切酶TaqI0.5ul，限制性内切酶的缓冲液2μl，加水至终体积20ul，混匀；在37℃恒温下酶切反应4小时，酶切产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察并记录酶切结果，黑皮质素受体‑4基因扩增产物具有1个酶切位点，其中156bp位点可被切开，产生2个等位基因：其中切不开的为F等位基因226bp，可被切开的为H等位基因156bp+70bp；含有226bp条带的命名为FF型；含有226bp+156bp+70bp条带的命名为FH型；含有156bp+70bp条带的命名为HH型；(5)、各基因多态性与生长速度相关分析对生长有利的单个基因的基因型分别是：胰岛素样生长因子‑I基因为BB型；垂体特异性转录因子‑I基因为EE型；肝X受体α基因为GG型；黑皮质素受体‑4基因为FF型；但是，由于基因间可产生互作效应，只根据单基因对生长性能的影响而进行选择的话，会产生负面影响，对四种基因的81种基因型进行了聚合基因效应分析，分析结果显示，胰岛素样生长因子‑I、垂体特异性转录因子‑I、肝X受体α和黑皮质素受体‑4基因的聚合基因型为AADDGGFF的个体生长速度最快，达90kg日龄最小；因此在大群体世代选育中，只经过1个世代的选育使优良基因达到纯合，加速瘦肉型淮猪快生长品系的培育。