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一种牛奶中土霉素残留ELISA检测方法，其特征在于通过以下步骤实现：（1）土霉素免疫原和包被抗原的合成、鉴定采用重氮法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂（O‑tolidine）与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原（OTC‑tolidine‑BSA）；再用相同方法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂（O‑tolidine）与卵清蛋白（OVA）偶联得到包被抗原（OTC‑tolidine‑OVA）；将BSA、OVA、OTC、O‑tolidine和偶联产物，于波长190～400nm下进行紫外扫描鉴定；同时也对合成免疫原以及载体蛋白BSA做SDS‑PAGE电泳实验进行鉴定；（2）单克隆抗体的制备取50～100μg 步骤（1）所得的免疫原与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化，常规免疫方法免疫Balb/C小鼠，取出抗血清效价4000以上的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，具体操作依 ClonaCellTM‑HY Hybridoma Cloning Kit说明进行；经ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆化，建立能稳定分泌抗OTC的杂交瘤细胞株，获得抗OTC单克隆抗体；（3）OTC间接竞争性ELISA检测1）包被抗原：①每孔加100μL1000×稀释的包被抗原OTC‑OVA； ②37℃孵育2h，后洗涤液洗涤2次，扣干；2）封 闭：③每孔加入150μL的封闭液；④37℃孵育2h，后洗涤液洗涤3次，扣干；3）加 样：⑤每孔加入50μL待测样品，50μL1万×稀释的单抗；⑥37℃孵育30min，后洗涤液洗涤5次，扣干；4）酶标二抗：⑦每孔加入100μL5000×稀释的羊抗鼠IgG：HRP酶标二抗；⑧37℃孵育30min，后洗涤液洗涤5次，扣干；5）显色反应：⑨每孔加入100μL底物反应液，37℃避光反应20min；6）终 止：⑩每孔加入50μL终止液终止反应，5min后测OD值。 |
