连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，公开了连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法。本发明核酸信号扩增检测方法包括1)核酸侵入信号扩增阶段，形成flap片段的积累；2)flap连接阶段，将flap片段与分子信标上的另一寡核苷酸相连，形成切刻内切酶位点；3)切刻内切酶信号扩增阶段，切刻内切酶只切割分子信标链，使分子信标的荧光基团与淬灭基团分离，新的完整的分子信标会再次与连接的flap片段杂交，从而使靶核酸信号得到扩增；4)靶核酸信号检测阶段。利用本发明检测方法，能够对核酸靶序列进行检测，并且由于核酸侵入反应具有很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测。

主权项

利用连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法，其特征在于依次包括以下步骤：1)核酸侵入信号扩增阶段：设计针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针有一段翘起片段，称为5’flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度在核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度±1℃范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的解链温度要高于核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度5～10℃；所述的靶核酸与所述的上、下游探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针‑靶核酸特异性结构，其中下游探针浓度大于上游探针浓度；向反应体系中加入核酸5’外切酶或5’flap内切酶，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别所述的探针‑靶核酸特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，可以牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针‑靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累；2)flap连接阶段：向步骤1)的反应体系中加入连接酶体系及环状部分杂交有一段5’磷酸化的寡核苷酸的分子信标，在所述的连接酶体系中连接酶的作用下，步骤1)核酸侵入信号扩增产生的flap片段会与所述的分子信标环状部分的5’磷酸化的寡核苷酸相连，将分子信标打开发出荧光信号，同时连接好的flap片段与信标形成的双链上的切刻内切酶识别位点形成，得到能发出荧光信号且含有切刻内切酶识别位点的连接产物；3)切刻内切酶信号扩增阶段：将切刻内切酶反应体系加入到步骤2)得到的连接产物中，所述的切刻内切酶反应体系中的切刻内切酶识别所述的切刻内切酶识别位点，并只切割分子信标链，切割后的分子信标两部分片段与未切割的完整的分子信标相比，解链温度低，在切刻内切酶酶切反应温度下会与连接的flap片段分离，使分子信标的荧光基团与淬灭基团分离，新的完整的分子信标会再次与连接的flap片段杂交，形成新一轮的切刻内切酶切割循环，这一过程使荧光信号逐渐增强，从而使靶核酸信号得到扩增；4)信号检测阶段：对步骤3)扩增得到的靶核酸信号进行检测。