一种快速双向多位点基因突变的方法

摘要

本专利涉及一种快速双向多位点基因突变的方法。本方法以改进的重叠延伸PCR方法为基础，利用带有突变位点的序列特异性引物，通过两轮PCR扩增和DNA片段连接实现DNA双向多位点基因突变。本方法可广泛用于目的基因定点突变，基因合成，蛋白结构-功能研究、蛋白质表达优化和目的基因包装。本方法按照需要实现突变的DNA片段序列特点，设计出三个DNA片段和三对相应特异性扩增引物。通过两步PCR扩增和特定的扩增程序设定，得到引入所需突变位点的目的基因片段。

主权项

一种快速双向多位点基因突变的方法，其特征在于以下步骤：1）在需突变基因的序列范围及其上下游选定三个DNA 片段，设计三对引物，引物分别表示为F1F和F1R，F2F和F2R，以及F3F和F3R（Fi（i=1，2和3）表示3个DNA片段，F表示上游引物，R表示下游引物），其中F1R，F2F，F2R和F3F含有突变序列；2）进行第一轮PCR，以待突变基因为模板，利用上述三对引物扩增，得到含有突变序列的DNA片段产物F1，F2 和F3，其序列特点为F1片段的3’端和F2片段的5’端部分序列相同并含有相同的突变序列，F2片段的3’端序列和F3片段的5’端部分序列相同并含有相同的另一段突变序列；3）以F1，F2 和F3三个片段作为扩增模板，采用重叠延伸PCR方法，利用三个片段间重叠部分的片段作为铰链，将含有突变序列的三个片段相连接并以F1T和F3R为引物进行第二轮PCR，扩增即可得到目的基因产物。