| 主权项 |
一种DNA分子测序的方法，包括如下步骤：(1)以来自一个待测样本的双链DNA分子为模板，用单链DNA片段甲和单链DNA片段乙组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，得到目的待测双链DNA分子；所述目的待测双链DNA分子由单链DNA分子1和单链DNA分子2组成，且单链DNA分子1和单链DNA分子2反向互补；所述单链DNA片段甲为所述单链DNA分子1的5’端区域；所述单链DNA乙包括所述单链DNA分子2的5’端区域；(2)将步骤(1)的PCR扩增产物进行磷酸化；(3)将步骤(2)的产物单链化并与单链DNA片段丙及dNTP共孵育，所述单链DNA分子1的5’端区域与所述单链DNA片段丙的3’端区域配对形成双链，所述单链DNA分子1的3’端区域与所述单链DNA片段丙的5’端区域配对形成双链；在DNA聚合酶的作用下，所述单链DNA分子1的5’端区域与3’端区域通过与所述单链DNA片段丙的分子条码区域互补的核苷酸连接成环；所述单链DNA片段丙自5’末端至3’末端依次包括三个区域：所述单链DNA分子2的5’端区域、分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域；所述分子条码区域由选自A、T、C和G的10至16个核苷酸组成；(4)将步骤(3)的产物用核酸外切酶进行消化，去除没有成环的单链DNA分子；(5)以步骤(4)的产物为模板进行滚环复制；(6)将步骤(5)的产物的粘末端补平；(7)将步骤(6)的产物用核酸外切酶进行消化，去除单链DNA分子；(8)将步骤(7)的产物进行超声破碎并回收与待测双链DNA分子大小近似的片段；(9)将步骤(8)回收的片段进行末端修复和缺口连接；(10)将步骤(9)的产物进行磷酸化；(11)将步骤(10)的产物进行第一次测序；(12)完成步骤(11)后，以所述单链DNA片段甲为测序引物进行第二次测序，读取分子条码信息；(13)将具有相同分子条码的测序结果进行拼接，每种分子条码获得一个具体的测序结果。 |
