沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法和试剂盒及应用

摘要

本发明公开了一种带有内标的，以沙门氏菌sigD/sigE基因为靶标的逆转录荧光定量PCR快速检测方法，其中包括经三次PCR扩增得到的RNA内标。另外，本发明还提供了相应试剂盒以及应用。本发明可广泛用于实验室研究、食品安全、医药卫生等众多领域，不但能避免假阴性漏检的现象以有效监控PCR扩增，而且沙门氏菌属的检测特异性强，可有效区分死细菌和活细菌，快速，检测灵敏度高，并可以应用于食品中沙门氏菌的高通量筛检。

主权项

一种沙门氏菌内标逆转录荧光定量快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取样品中的RNA；(2)制备内标，包括如下步骤：A.以原壳小球藻的cDNA或GenBank登录号GU269622.1所示的核酸为模板，用引物zds‑F：5’‑GTTGGTGGGCGTGCCTGTGA‑3’(SEQ ID NO.1)和zds‑R：5’‑AAGTACGGGTCGGCGGGTGT‑3’(SEQ ID NO.2)进行第一次PCR扩增，得到初始PCR产物；B.以初始PCR产物为模板，用引物s45‑F/zds‑F：5’‑TGGCATAAAGGGACAGCACGTTGGTGGG CGTGCCTGTGA‑3’(SEQ ID NO.3)和s45‑R/zds‑R：5’‑AGCGGCAAAGATCGTACAGAAGTACGGG TCGGCGGG TGT‑3’(SEQ ID NO.4)进行第二次PCR扩增，得到第二次PCR产物；C.以第二次PCR产物为模板，用引物T7/s45‑F：5’‑AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGA TGGCATAAAGGGACAGCAC‑3’(SEQ ID NO.5)和S45‑R：5’‑AGCGGCAAAGATCGTACAG‑3’(SEQ ID NO.6)，进行第三次PCR扩增，得到第三次PCR产物；D.将第三次PCR产物转录成RNA，作为内标，该内标RNA序列如SEQ ID NO.9所示；(3)将步骤(1)获得的RNA与步骤(2)获得的内标RNA混合，进行逆转录实时荧光定量PCR检测。