一种基于量子点荧光定量检测过敏原α-乳白蛋白的方法

摘要

一种基于量子点荧光定量检测过敏原α-乳白蛋白的方法及其应用，以α-乳白蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，利用荧光量子点偶联标记α-乳白蛋白单克隆抗体，采用竞争性免疫吸附法形成荧光免疫复合物，然后在全波长多功能酶标仪下检测荧光信号，通过建立标准曲线，实现食品中过敏原α-乳白蛋白的定量检测。本发明构建的方法可广泛应用于各种粉剂和液态奶制品中相关过敏原检测，且具有快速、准确、灵敏度高、重现性好和特异性佳等特点，为高通量检测多种食品中相关过敏原提供了一种有效的手段，具有良好的推广和应用前景。

主权项

一种基于量子点荧光定量检测过敏原α‑乳白蛋白的方法，其特征是按下列步骤：（1）以α‑乳白蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，采用腹部皮下多点注射方式免疫，利用细胞融合技术将脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得可分泌抗体的细胞株，通过筛选得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并借助小鼠体内诱生腹水法大量制备抗体，最后经辛酸‑硫酸铵沉淀法纯化得到α‑乳白蛋白单克隆抗体；（2）将羧基修饰后的CdSe/ZnS量子点、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐、 N‑羟基琥珀酰亚胺和α‑乳白蛋白单克隆抗体按1:10:6:4的摩尔比进行偶联，其中1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐、 N‑羟基琥珀酰亚胺均用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液配制，取CdSe/ZnS量子点加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐溶液中室温涡旋活化5 min后，再加入N‑羟基琥珀酰亚胺溶液反应5‑10min，最后取α‑乳白蛋白单克隆抗体加入反应液后涡旋混匀，置于37℃摇床上避光反应1.5‑2h；偶联结束后，将偶联产物用截留分子量为3kDa的超滤管超滤除去剩余的偶联剂，浓缩；（3）用磷酸盐缓冲液平衡层析柱，流速0.2 mL/min；取步骤（2）的偶联混合物上样，上样结束后，用磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱前期的洗脱液，即为纯化后的量子点标记α‑乳白蛋白单克隆抗体；（4）用碳酸盐缓冲液稀释步骤（3）得到的α‑乳白蛋白，96孔酶标板每孔100 μL，4℃包被过夜，PBS清洗三次，每次5 min扣干，每孔加250 μL，1%明胶液37℃封阻1 h后清洗，每孔加入浓度梯度已知的α‑乳白蛋白与量子点标记α‑乳白蛋白单克隆抗体预混液100 μL，37℃反应1 h后采用荧光酶标仪检测吸光值，根据吸光值与浓度的关系绘制α‑乳白蛋白标准曲线；（5）样品检测：将所需检测食品进行去脂预处理，包被α‑乳白蛋白、封阻清洗后，每孔加入经预处理的乳制品与量子点标记的α‑乳白蛋白单克隆抗体预混液100 μL，37℃反应1h，荧光酶标仪检测吸光值，得到的吸光值带入标准曲线计算出被检食品中过敏原α‑乳白蛋白的含量。