单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用

摘要

本发明公开一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品、其建立方法及应用，其通过菌株培养、鉴定、核酸标准样品的制备、核酸标准样品的干燥、均匀性和稳定性检查、定性检定、核酸标准样品定值等项工作,获得一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品。本发明解决了国内食品中致病菌核酸标准样品紧缺的状况，对解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义，并对开展食品中致病菌分子生物学检测工作，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。

主权项

一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）标准样品，其特征在于：制备方法的具体步骤如下：Ⅰ.基因组核酸的提取①单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644，经菌株活化、增菌培养；②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4℃离心15min；③吸弃上清，取沉淀1~3mL，加pH8.0的TE溶液10mL悬浮，加0.5mL浓度为100g/L SDS和50μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h；④加2mL浓度为5mol/LNaCl，混匀，加1.5mLCTAB‑NaCl混合溶液，混匀，65℃温浴20min；其中，CTAB‑NaCl混合溶液为100g/L CTAB和0.7mol/L NaCl；⑤取上清，加与上清等体积的酚‑氯仿‑异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，酚‑氯仿‑异戊醇混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；⑥取上清，加与上清等体积的氯仿‑异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，氯仿‑异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；⑦取上清，加上清0.6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心10min；⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL pH8.0的TE溶液溶解，获得单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644基因组核酸溶液；⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，分装核酸样品并进行冷冻干燥；Ⅱ.冷冻干燥①样品预冻：先把步骤Ⅰ所得的核酸样品在‑80℃低温冷冻2h；②冷冻过程：置干燥室制冷，温度降至‑35℃时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至‑40℃时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0.5Torr时，结束冷冻过程；③样品干燥：干燥室温度设置为15℃，当真空度降至0.1Torr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644基因组核酸标准样品，置于‑20℃中避光贮存。