阿尔茨海默病早期诊断液相芯片及其制备方法

摘要

本发明公开了一种阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，主要包括有：包被微球：含有分别包被了t-tau捕获抗体的微球，包被了p-tau231捕获抗体的微球，包被了p-tau181捕获抗体的微球，包被了p-tau199捕获抗体的微球，和包被了Aβ1-42捕获抗体的微球，上述微球具有不同颜色编码；分别用生物素标记的检测抗体；链亲和素藻红蛋白。本发明所提供的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点。同时，各项神经生化损伤标志物可自由组合，使用方便。同时，由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构象，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高。

主权项

一种阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，其特征是，主要包括有：1)包被微球：含有分别包被了t‑tau捕获抗体的微球，包被了p‑tau231捕获抗体的微球，包被了p‑tau181捕获抗体的微球，包被了p‑tau199捕获抗体的微球，和包被了Aβ1‑42捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；2)生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的t‑tau、p‑tau231、p‑tau181、p‑tau199及Aβ1‑42的检测抗体；和3)链亲和素藻红蛋白；每种相应的捕获抗体包被微球的制备如下：‑将50μL微球活化后，≥15000rpm，离心；‑吸弃上清液，将微球重悬于pH5.0的230‑280μL 50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min，后将微球于≥15000rpm，离心；重复该步骤；‑吸弃上清液，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；‑往悬浮的微球中加入相应的0.8‑1.2μg抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450‑550μL；‑用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5‑2.5hr；‑偶联了抗体后的微球以≥12000g的速度，离心8‑12min；‑吸弃上清液，将微球重悬于500μL PBS‑TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；‑室温避光振荡30min；再于≥12000g，离心8‑12min；‑吸弃上清液，将微球重悬于1mL PBS‑TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；微球≥12000g，离心4‑6min；重复该步骤一次；‑吸弃上清液，将微球重悬于500‑1000μL PBS‑TBN溶液中；‑每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2‑8℃避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为110‑140个/μl；每种检测抗体的生物素标记的制备如下：‑依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至浓度为1mg/ml时的体积，视为目标 体积；‑用DMSO溶解，配置10mg/ml的NHS‑Biotin反应液；‑按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS‑Biotin反应液；‑加入体积为目标体积的1/10的pH8.9的NaHCO3溶液；‑加入pH7.4的PBS补至目标体积；‑包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3‑5小时，转速为800rpm‑1000rpm；‑将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS‑Biotin；‑使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到1‑3μg/ml。