干酪乳杆菌Zhang中脂酶Est C的蛋白序列

摘要

本发明涉及一种干酪乳杆菌Zhang中脂酶Est C的蛋白序列，提供了一种新的干酪乳杆菌脂酶Est C的编码核苷酸序列，该序列是干酪乳杆菌Zhang应激密切相关的基因，该序列的核苷酸序列与已公布的干酪乳杆菌BL23的核酸序列FM177140的核酸序列有99％的相似性。本发明还提供了干酪乳杆菌Zhang中的Est C基因的核酸序列，该核酸序列为SEQ ID NO：1，本发明还提供了一种分离出的干酪乳杆菌Zhang脂酶Est C的氨基酸序列，该序列的氨基酸序列为SEQ IDNO：2。

主权项

1.一种干酪乳杆菌Zhang中脂酶Est C基因的克隆和测序方法，该方法包括步骤：(1)PCR引物设计与合成；(2)干酪乳杆菌DNA的提取；(3)目的片断的PCR扩增；(4)琼脂糖凝胶电泳检测；(5)目的基因片断回收与鉴定；(6)目的基因片断的克隆与鉴定；(7)测序，其特征在于PCR引物的正向引物为SEQ ID NO：3和反向引物为SEQ ID NO：4，其序列信息如下：SEQ ID NO：3：5’-TAATGACGGTTATTCGTGC-3’SEQ ID NO：4：5’-TGTGTTGGTTCTTGTTGAG-3’；其中干酪乳杆菌DNA的提取步骤如下：细菌培养液5ml，10,000rpm离心1分钟，弃上清；加入适量溶菌酶溶液，使其最终浓度为20mg/ml，彻底悬浮，37℃处理30-60分钟；加入20μl蛋白酶K溶液，其浓度为20mg/ml，混匀；加220μl缓冲溶液GB，振荡15秒；70℃放置30分钟；加入220μl无水乙醇，充分振荡15秒；将溶液加入吸附柱中，12,000rpm离心30秒；加500μl去蛋白液GD，12,000rpm离心30秒，弃废液；加700μl漂洗液GW，12,000rpm离心30秒，弃废液；加500μl漂洗液GW，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；再次12,000rpm离心2分钟，将吸附柱置于室温数分钟；将吸附柱转入干净的离心管中，加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温置2-5分钟，12,000rpm离心30秒；离心得到的溶液再次加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，即得到干酪乳杆菌Zhang基因组DNA；其中目的片断的PCR扩增的扩增体系为：0.2μl Taq聚合酶，2.5μl 10×PCR缓冲液，2μl dNTP，2μl 25mM的MgCl20.2μl 50pM的正向引物，0.2μl 50pM的反向引物，1μl基因组DNA和17.4μl ddH₂O，扩增条件为：97℃变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，如此进行35次循环；72℃延伸10min，4℃保存；其中琼脂糖凝胶电泳检测的步骤为：取PCR产物5μl，同1μl上样缓冲液混合均匀，点样于琼脂糖凝胶孔中，在另一孔中加入5μl DL2000Marker，120V/cm电压下电泳30min，电泳结束后，在凝胶成像系统GDS-8000System上留取照片；其中目的基因片断回收与鉴定的操作步骤如下：在紫外灯下迅速将含有目的片段条带的琼脂糖块割下，放入1.5ml的离心管中；胶块中加入3倍体积溶胶液PN，置50℃水浴放置10分钟，使琼脂糖块完全溶化；将溶化后的琼脂糖块移入吸附柱CA1或CA2中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的液体；将吸附柱放入同一个收集管中，在吸附柱中加入700μl漂洗液PW，13,000rpm，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm离心30秒，倒掉废液；将离心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液；将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，晾干；将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟；13,000rpm离心1分钟收集DNA溶液；其中目的基因片断的克隆与鉴定的步骤如下：感受态细胞的制备挑取JM109大肠杆菌原种，LB琼脂板上划线；过夜培养后挑取新鲜单菌落，接种到100ml LB培养基中，37℃摇菌160转/分钟培养2-3小时，至OD₆₀₀达到0.4-0.5时将菌液移至灭菌预冷的100ml离心管中，冰浴10-15分钟；4,000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀；加入20ml经过过滤除菌并经预冷的0.1M CaCl₂悬浮细菌沉淀；冰浴10-15分钟后于4,000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀；加入4ml 0.1M CaCl₂悬浮细菌沉淀；该细胞可直接用于转化实验；加甘油至终浓度为15％-20％，混匀，每份分装成100μl于1.5ml EP管中，冻存于-70℃冰箱中；回收片段同T载体的连接首先在EP管中制备下列连接反应液：然后将上述反应液在16℃反应30分钟，产物用于转化感受态细胞；质粒的转化从-70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶；将100μl感受态细胞加入10μl连接产物，冰浴30分钟后于42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟；加入400μl液体LB培养基，37℃复活50分钟后取100μl铺于LB平板上，平板含0.1(V/V)的氨苄青霉Amp，X-gal和IPTG；最后于37℃恒温培养10-15小时；白色菌斑应含重组质粒；转化菌落的PCR鉴定与培养用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取白色单菌落；将牙签头放入在加有不含模板的PCR反应液的EP管中晃动，进行PCR扩增；将PCR产物同Marker一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；得到目的片段后，用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40ml含0.1％(V/V)的青霉素钠LB液体培养基中，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收和测序。