昆虫病原真菌转酸性海藻糖酶基因菌株及制备方法和用途

摘要

昆虫病原真菌转基因菌株，其含有同源或异源酸性海藻糖酶组成性外源基因；其是通过构建酸性海藻糖酶基因全长cDNA组成性表达载体，然后建立液生分生孢子转化体系，再进行选择性地筛选制得的；本发明昆虫病原真菌转基因菌株在制备真菌农药中的应用。本发明昆虫病原真菌转基因菌株表达海藻糖酶的效率高；本发明制备方法易操作、重复再现性好；本发明昆虫病原真菌转基因菌株应用于真菌农药中，该真菌农药作用于昆虫体内时，通过转基因菌株的超量表达酸性海藻糖酶基因，使昆虫寄主体内酸性海藻糖酶活性被提高，加速了海藻糖利用，促进了病原真菌在寄主昆虫体内生长，从而有效地提高了真菌农药如绿僵菌、白僵菌等真菌农药的杀虫活性。

主权项

一种昆虫病原真菌转基因菌株，其特征在于：所述转基因菌株是通过PCR聚合酶链式反应扩增绿僵菌CQMa102酸性海藻糖酶基因全长cDNA核酸序列，并将其克隆到以除草剂抗性基因——Bar基因为筛选标记的真菌表达载体pBarEx或以Benomyl抗性基因——β‑微管蛋白基因为筛选标记的真菌表达载体pBGFP，使ATM基因处于来自构巢曲霉3‑磷酸甘油醛脱氢酶gpdA基因的启动子或磷酸丙糖异构酶tpiA 基因的启动子与色氨酸合成酶trpC基因的终止子控制之下，得到海藻糖酶基因组成型表达载体pBarEx‑ATM或pBGFP‑ATM；再建立利用基因枪法转化绿僵菌液生分生孢子的体系，将pBarEx‑ATM或pBGFP‑ATM整合到绿僵菌基因组中；最后经过抗性筛选和聚合酶链式反应法筛选得到的；所述pBarEx是根据pBGFP构建的：设计引物1与引物2，从构巢曲霉基因组DNA中扩增色氨酸合成酶启动子PtryC序列；设计引物3与引物4，从pCAMBIA 3300中扩增Bar基因序列；以引物1与引物4，采用融合PCR扩增PtryC控制下的Bar盒；将pBGFP与Bar盒分别采用AatII与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接构建成丝状真菌表达载体pBarEx；所述引物1为5’‑attagacgtcgcaggtcgacagaagaatgac‑3’，下划线为Aat II酶切位点；所述引物2为5’‑gtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatccactagagcggccgc‑3’；所述引物3为5’‑gcggccgctctagtggatctaccatgagcccagaacgacgcccggccgac‑3’，与引物2反向互补序列，其中atg为Bar基因起始密码子；所述引物4为5’‑cgcggatccagcttttattagatctcggtgac‑3’，下划线为BamHI酶切位点。