谷氨酰胺转运蛋白1融合蛋白表达载体及其构建方法和应用

摘要

本发明涉及生物工程领域，为融合蛋白载体构建和表达检测技术，公开了一种谷氨酰胺转运蛋白1融合蛋白表达载体，将谷氨酰胺转运蛋白1基因片段与HA标签蛋白基因片段和加强型绿色荧光蛋白基因片段依次连接，构建在真核表达载体pBK-CMVΔ上；谷氨酰胺转运蛋白1的C端与HA标签蛋白N-端直接相连，HA标签蛋白的C-端与加强型绿色荧光蛋白的N-端连接在一起，HA标签蛋白与加强型绿色荧光蛋白的第一个氨基酸M之间有4个氨基酸形成的铰链，序列为GAAA，碱基序列为ggagcggccgca。所得到的载体能用于将SNAT1基因转入真核细胞，使其在真核细胞中大量表达，同时也是检测大鼠谷氨酰胺转运蛋白1(SNAT1)在真核细胞膜上的表达、定位和定量的有效方法，使之能应用于SNAT1的结构与功能的研究中。

主权项

谷氨酰胺转运蛋白1融合蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)PCR扩增并纯化回收含有加强型绿色荧光蛋白基因的基因片段，并将该基因片段用NotI酶酶切；用NotI酶酶切含有谷氨酰胺转运蛋白1基因和HA标签蛋白基因的真核表达载体质粒pBK‑CMVΔ‑SNAT1‑HA；并回收载体大片段；(2)用T4DNA连接酶将酶切纯化的加强型绿色荧光蛋白基因片段和pBK‑CMVΔ‑SNAT1‑HA载体大片段在15～18℃下恒温保持4～8小时进行连接；(3)用连接产物转化感受态细胞，卡那霉素筛选，挑取重组体单菌落培养并鉴定所得到的重组质粒；(4)将鉴定正确的重组质粒定点突变，把HA标签蛋白基因和加强型绿色荧光蛋白基因之间的终止密码子突变成gga。