一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法

摘要

一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法，属于生物分析化学技术领域。本发明运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌，包括沙门氏菌培养，磁性纳米粒子的制备，沙门氏菌基因组DNA的提取，沙门氏菌特异性引物的选择，PCR扩增，PCR产物的DHPLC检测。本发明以DHPLC检测PCR产物代替传统的琼脂糖电泳，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的；PCR-DHPLC检测方法与传统微生物检验方法以及PCR-凝胶电泳法相比，具有敏感性高、特异性强、快速、准确、结果分析简单，对待样品要求不高，可进行大通量检测等优点。

主权项

一种运用PCR‑DHPLC检测沙门氏菌的方法，其特征在于包括沙门氏菌培养，磁性纳米粒子的制备，沙门氏菌基因组DNA的提取，沙门氏菌特异性引物的选择，PCR扩增，PCR产物的DHPLC检测；工艺步骤为：(1)沙门氏菌培养：将沙门氏菌菌株一环接种于10mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液，于36℃培养10h；(2)磁性纳米粒子的制备：制备羧基修饰的磁性纳米粒子，用于吸附沙门氏菌基因组DNA；①取0.65g FeCl3，0.4g柠檬酸三钠，和20mL乙二醇，搅拌反应10min；②取1.2g醋酸钠加入步骤①所得溶液中，搅拌反应20min；③将步骤②所得溶液在220‑230℃下搅拌反应10h；④向步骤③所得溶液中加入20mL无水乙醇，超声10min，6000rpm离心10min，去上清；⑤向步骤④所得沉淀中加入20mL去离子水，超声10min，6000rpm离心10min，去上清；⑥向步骤⑤所得沉淀中加入5mL去离子水，得到粒径为350nm的磁性纳米粒子，备用；(3)沙门氏菌基因组DNA的提取：①取(1)中增菌液1mL，10000rpm离心5min，去除上清；②将步骤①所得沉淀用1mL TE缓冲液溶解，加入100μL 10％十二烷基磺酸钠SDS；所用TE缓冲液组成为：含50mM Tris‑HCl和10mM乙二胺四乙酸EDTA的溶液，pH8.0；③向步骤②所得溶液中加入20μL制备的磁性纳米粒子；④向步骤③所得溶液中加入370μL质量浓度30％PEG 6000‑6mol/L NaCl混合液，室温反应15min；⑤将步骤④所得溶液放入磁力架中，去除上清；⑥向步骤⑤所得磁性纳米粒子中加入1mL质量浓度70％乙醇；⑦将步骤⑥所得溶液放入磁力架中，去除上清；⑧向步骤⑦所得磁性纳米粒子中加入100μL TE缓冲液溶解，65℃反应10min，此时所用TE缓冲液组成为：含10mM Tris‑HCl和1mM EDTA，pH8.0；⑨将步骤⑧所得溶液放入磁力架中，取上清，即为沙门氏菌基因组DNA；(4)设计沙门氏菌特异性引物：上游引物S1为：5’‑CTG CCG CAG TGT TAA GGA TA‑3’，下游引物S2为：5’‑CTG TCG CCT TAA TCG CAT GT‑3’；(5)以得到的沙门氏菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增：取沙门氏菌基因组DNA模板1μL，分别加入浓度10μM的引物S1、S2各1μL，浓度20μM的dNTP 1μL，酶活5U/μL的TaqDNA聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer5μL，加水补足到50μL，把各组分加到0.2mL的PCR反应管中，按下列参数进行PCR循环；预变性：94℃3min；进入循环：94℃变性60s，59℃退火60s，72℃延伸60s，循环扩增35次；终止延伸：72℃10min；4℃保存PCR扩增产物；(6)PCR产物的DHPLC检测：将获得的PCR扩增产物进行DHPLC检测，从而达到检测沙门氏菌的目的；色谱柱：PS‑DVB & C18DNA Sep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；柱温：50℃；流动相：体积比：缓冲溶液A浓度为50.2％，缓冲溶液B浓度为49.8％，其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的乙酸三乙胺TEAA水溶液，缓冲液B是浓度0.1MTEAA与乙腈按照体积比3∶1的混合溶液；流速：0.9mL/min；检测器：荧光检测器：光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；上样量：PCR扩增产物5μL。