一种检测外周血克隆特异性T淋巴细胞的方法

摘要

一种检测外周血克隆特异性T淋巴细胞的方法，包括：抽提外周血单个核细胞总RNA并逆转录成cDNA。设计T细胞受体β链可变区(TCR BV)24个家族的上游引物和共同下游引物，染料法(SYBR Green I)实时荧光定量PCR扩增cDNA。熔解曲线分析PCR产物，PCR产物荧光强度变化的负一次导数(-dF/dT)与温度(Tm)间作图，得到BV 24个家族峰形图，根据BV 24个家族峰形图上单峰出现情况，从而判断克隆特异性T淋巴细胞在外周血中分布情况。本发明方法可用于检测感染性疾病、自身免疫病、肿瘤或移植排斥中克隆特异性T细胞出现情况，用于评价机体对疫苗的应答情况等。

主权项

一种检测外周血克隆特异性T淋巴细胞的方法，所述方法包括如下步骤：(1)制备抗凝的外周血待检样本；(2)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，试剂盒抽提PBMC中总RNA，并采用MBI公司逆转录试剂盒逆转录成cDNA；(3)以T细胞受体(TCR)beta链可变区(BV)24个家族的26条引物分别为上游引物，其中BV5，BV13各设有2条上游引物；BC1、BC2区域设计共同下游引物BC，上面步骤(2)制备的cDNA为模板，染料法SYBR Green I实时荧光定量PCR进行扩增；(4)熔解曲线分析cDNA的PCR产物，通过对PCR产物荧光强度变化负一次导数(‑dF/dT)与温度(Tm)间作图，得到TCR BV 24家族各家族相应峰形图，统称为基因熔解谱型图(Gene melting spectratyping，GMST)；(5)根据基因熔解谱型图上各BV家族峰形分布，若某一家族在GMST上只出现单峰，则表明该BV家族中的T淋巴细胞为特异性单克隆扩增，若GMST上BV各家族均无单峰图形出现，则说明外周血中不存在T淋巴细胞特异性扩增。