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Método para detectar la presencia de una mutación puntual de una molécula de ácido nucleico diana en unantecedente de moléculas naturales de ácido nucleico, que comprende las etapas de:a. obtener una muestra de ácido nucleico;b. poner en contacto dicha muestra de ácido nucleico, en condiciones de reacción apropiadas, con una solución quecomprende una mezcla de oligonucleótidos y una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena bajocondiciones de hibridación, en el que dicha mezcla de oligonucleótidos consiste en cebadores adecuados para unaamplificación isotérmica mediada por bucle de la región de la molécula de ácido nucleico incluyendo teóricamente lamutación puntual, comprendiendo dichos cebadores:i) dos cebadores externos F3 y B3;ii) dos cebadores internos FIP y BIP, en el que FIP incluye dos secuencias de oligonucleótidos F2 y F1c, y BIP incluyedos secuencias de oligonucleótidos, B2 y B1c, en el que dichos cebadores internos FIP y BIP pueden reconocer ehibridarse a dos regiones diferentes y opuestas, F2c y B2c respectivamente, de la molécula de ácido nucleico diana,en el que el cebador BIP está diseñado para hibridarse corriente abajo de la mutación puntual, o bien el cebador FIPestá diseñado para hibridarse corriente arriba de la mutación puntual, y en el caso de que el cebador BIP esté diseñadopara hibridarse corriente abajo de la mutación puntual, entonces el cebador FIP está diseñado para hibridarse a lasecuencia diana de modo que la mutación puntual se sitúe en o corriente abajo de la secuencia de F2c y corrientearriba de F1c, o en el caso de que el cebador FIP esté diseñado para hibridarse corriente arriba de la mutación puntual,entonces el cebador BIP está diseñado para hibridarse a la secuencia diana de modo que la mutación puntual se sitúeen o corriente arriba de la secuencia de B2c y corriente abajo de B1c;iii) un cebador extensible autoalineado LB o LF respectivamente, que comprende:- una secuencia de bucle central que puede reconocer selectivamente e hibridarse a la región que comprende lamutación puntual teórica de la molécula de ácido nucleico sólo si está presente la mutación puntual,- una secuencia de extremo 5', y- una secuencia de extremo 3', siendo dichas secuencias de extremo 5' y de extremo 3' complementarias entre sí paraformar un tallo, de modo que dicha secuencia de bucle central tenga una afinidad de hibridación mayor para la regiónque comprende la mutación puntual teórica de la molécula de ácido nucleico que la afinidad de hibridación de lasecuencia de extremo 5' con respecto a la secuencia de extremo 3', de modo que de como resultado un alineamientoy amplificación de la región que comprende la mutación puntual teórica de la molécula de ácido nucleico;iv) un resto no extensible para reconocer e hibridarse selectivamente a la secuencia WT (natural) de la molécula deácido nucleico;c. incubar la mezcla resultante a una temperatura constante;d. detectar una señal indicativa de amplificación de la molécula de nucleótido que comprende la mutación puntual.
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