一种链霉菌微型转座突变系统及其构建方法和应用

摘要

本发明属于生物技术和基因工程领域，具体为一种高效的链霉菌微型转座突变系统及其构建方法和应用。本发明基于一种来源于诺卡氏菌NorcardiaasteroidsYP21的转座因子IS204，构建一系列含有IS204转座系统的转座子pDZY101~pDZY107，鉴定了天蓝色链霉菌中IS204转座酶作用位点的特征，并且证明了该转座系统具有良好的遗传稳定性和转座随机性。利用pDZY101及其衍生质粒对S.coelicolorM145进行转座突变，得到了大量的表型突变株，并且在变铅青链霉菌等其它链霉菌属成员中也发现了类似的特征,这些特点使得该转座系统在研究模式链霉菌功能基因上有着良好的应用前景。

主权项

一种用于转座质粒的构建方法，所述用于转座质粒的序列如SEQ ID No. 20所示，记为pDZY101；其特征在于具体步骤如下：以红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea为模板，用引物SEQ ID No. 3和引物SEQ ID No. 4扩增红霉素启动子片段，引物两端分别设计有XbaI和BamHI的限制性内切酶识别位点，把PCR产物片段与pMD19‑T载体做T‑A克隆后转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pT‑ermE ；以诺卡氏菌Nocardia asteroids(mexicana) YP21基因组为模板，以引物SEQ ID No. 5和引物SEQ ID No. 6扩增转座酶基因片段，引物两端分别设计有BamHI和EcoRI的限制性内切酶识别位点， 用BamHI和EcoRI酶切该PCR产物片段和质粒pT‑ermE，然后连接所得的两条线性片段，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pT‑ermE‑tnp；用XbaI和EcoRI分别酶切质粒pBY102和pT‑ermE‑tnp，再把所得线性片段用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，其序列如SEQ ID No. 20所示，记为pDZY101；所述质粒pBY102序列如SEQ ID No. 23所示。