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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Testkit zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen, umfassend die Schritte 1. matrizenabhängige Neusynthese der Targetnukleinsäure, 2. targetspezifische Sondenhybridisierung und 3. Nachwh gekennzeichnet, dass im ersten Schritt ein durch eine Markierung 1 markiertes Oligonukleotid 1, das vollständig oder teilweise zu der Targetsequenz komplementär ist, als Primer in der matrizenabhängigen Neusynthese der Target-nukleinsäure fungiert und im zweiten Schritt ein durch eine Markierung 2 markiertes Oligonukleotid 2, das aufgrund seiner niedrigeren Schmelztemperatur als das Oligonukleotid 1 nicht am ersten Schritt beteiligt ist, aber mit dem DNA-Neusyntheseprodukt von Oligonukleotid 1 teilweise oder vollständig hybridisiert. Dabei kann der Nachweis der Hybridisierungsreaktion sowohl fluorometrisch in Form eines homogenen Assays als auch zur Verifizierung des Ergebnisses nachfolgend immunologisch erfolgen. Die Detektionsreaktion erfolgt immer zeitlich nach erfolgter matrizenabhängiger Neusynthese.
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