海南粗榧细胞培养生产抗癌生物碱的方法

摘要

海南粗榧细胞培养生产抗癌生物碱的方法，涉及一种植物细胞培养生产抗癌生物碱方法。按照下述步骤进行：(1)高产有效生物碱海南粗榧植株筛选；(2)外植体诱导；(3)高产生物碱悬浮细胞培养系的建立；(4)二段法进行悬浮细胞培养；(5)生物碱分离与纯化。本发明可得到产量较高的有效生物碱，采用2L有效体积的搅拌式反应器在适宜条件下进行两步法培养50-70天，细胞生物量增至约4倍，细胞培养物中有效生物碱含量达细胞干重0.08％。最好情况可达到细胞干重的0.12％，这一结果比天然植物中含量高出约一个数量级。从而为解决珍稀濒危植物海南粗榧保护与资源开发利用提供技术保障；也为进一步探索海南粗榧的基因工程等莫定了基础。

主权项

海南粗榧细胞培养生产抗癌生物碱的方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)高产有效生物碱海南粗榧植株筛选：采集不同来源的海南粗榧成年植株，进行有效生物碱含量分析，选择含量最高植株作为外植体来源；(2)外植体诱导：取有效生物碱含量最高植株树皮作为外植体，用蒸馏水清洗干净，滤纸吸干后放入0.5‑2.0％次氯酸钠溶液中真空抽滤灭菌3‑8min，然后无菌水反复冲洗3‑6次；将外植体切成约0.5cm ×0.5cm方块，接种于如下愈伤组织诱导培养基上：0.5‑1Murashige and Skoog Stock培养基+0.01‑0.1mg·L‑16‑苄基嘌呤+0.5‑1mg·L‑1萘乙酸+0.05‑0.5mg·L‑1激动素+0‑100mg·L‑1肌醇+0.2‑0.6％琼脂+1‑5％蔗糖+1‑5％椰子乳，pH值5.0‑6.0；暗培养2d后再置于光照周期16h·d‑1、光照强度2000‑3000Lux的冷光灯下、环境温度25±2℃中继续培养3个月，每月继代一次，继代时用无菌解剖刀和无菌镊子挑、切取带生长旺盛愈伤组织的外植体接种到新培养基，便获得所需愈伤组织；(3)高产生物碱悬浮细胞培养系的建立：取愈伤组织接种到如下培养基里进行震荡培养：0.5‑1Murashige and Skoog Stock培养基+0.01‑0.1mg·L‑16‑苄基嘌呤+0.5‑1mg·L‑1萘乙酸+0.05‑0.5mg·L‑1激动素+0‑100mg·L‑1肌醇+1‑5％蔗糖+1‑5％椰子乳，pH值5.0‑6.0；暗培养2d后再置于光照周期16h·d‑1、光照强度2000‑3000Lux的冷光灯下、环境温度25士2℃，摇床转速为60‑200rpm；继续培养25‑35d后继代1次；继代5‑10次后分别测定悬浮细胞系产有效生物碱效率；选择产有效生物碱效率高者为高产生物碱悬浮细胞培养系；(4)悬浮细胞培养：采用二段法进行悬浮细胞培养，即细胞株系先在生长培养基中培养一段时间以累积生物量，再转入生产培养基促使细胞大量合成有效生物碱，将高产生物碱悬浮细胞培养系经无菌操作转入以下生长培养基中：pH值5.0‑6.5，含碳源浓度以质量与体积计为2‑6％、无机氮源离子浓度为40‑80mM、磷酸盐浓度为2‑6mM，激素水平是2，4‑二氯苯氧乙酸为0.5‑2mg·L‑1、6‑苄基嘌呤为0.5‑2mg·L‑1、萘乙酸为0.5‑3mg·L‑1、激动素为0.5‑2mg·L‑1、赤霉素为0.5‑2mg·L‑1、反玉米素为0.5‑2.5mg·L‑1及0.5‑1Murashige and Skoog Stock营养源的液体生长培养基进行悬浮培养，光照强度2000‑3000Lux的冷光灯下、环境温度25士2℃，摇床及搅拌式反应器转速为60‑250rpm，反应器的通气量0.1‑0.5vvm，培养25‑35天后，换生产培养基继续悬浮培养；生产培养基是pH为5.0‑6.0，含碳源浓度为以质量与体积计2‑4％、无机氮源离子浓度为30‑60mM、磷酸盐浓度为1‑3mM，激素种类及水平范围不变，及0.5‑1Murashige and Skoog Stock营养源的液体培养基，在如上所述的培养条件下继续培养25‑35天；(5)生物碱分离与纯化：收获上述培养的细胞，研碎，氨水湿润，加氯仿浸没，密闭，置摇床上振荡24h，滤取清液，减压浓缩至干，甲醇溶解残渣，进一步对细胞培养物中的有效生物碱采用半制备型HPLC法进行分离纯化，流动相为甲醇‑乙腈‑水29∶27∶44，并用氨水调节pH为8.5左右，流速1ml/min，检测波长：290nm，柱温：35℃，进样量：100μL。