应用毕赤酵母的pGAP调控表达异淀粉酶的方法

摘要

本发明属生物技术领域，是一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达异淀粉酶的方法，首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；构建由pGAP调控异淀粉酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中发酵工程菌分泌表达异淀粉酶。本发明生产成本低，发酵周期短，利用毕赤酵母的pGAP调控表达的异淀粉酶有利于产物的纯化，解决应用天然产异淀粉酶的菌株生产异淀粉酶的成本较高、产物难于纯化等的问题，有利于异淀粉酶的大规模生产。

主权项

一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达异淀粉酶的方法，其特征在于，其步骤如下：1)、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；2)、在异淀粉酶序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控异淀粉酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；3)、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；4)、将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28～30℃在生物反应器中发酵工程菌1～2d分泌表达异淀粉酶；所述液体培养基是由以下组分组成：85％磷酸25～28ml/L，CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L，K2SO4 17～19g/L，MgSO4·7H2O 13～16g/L，KOH 3.5～4.5g/L，碳源15～45g/L，蛋白胨18～22g/L，Yeast extract 8～12g/L，PTM4 3～5ml/L；所述PTM4是由以下组分组成：CuSO4·5H2O 2.0g/L，NaI·2H2O 0.1g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO3 0.02g/L，CoCl2·6H2O 1.05g/L，ZnCl2 7.0g/L，Fe2(SO4)3·7H2O 22g/L，生物素0.2g/L，硫酸1ml/L。