基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法

摘要

本发明公开了一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法：通过重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。本发明提供了一种大量分离膜蛋白的方法，利用杆状病毒感染昆虫细胞后以出芽的方式大量释放出来，致使细胞破裂，细胞剩余的膜因疏水作用而形成膜“小球”状，并且膜带有杆状病毒表达的HA融合蛋白，以此为膜蛋白的标志，经过多步纯化步骤获得宿主细胞剩余膜，过750kD中空纤维膜超滤后，再经HPLC和质谱分析，鉴定并找出目标膜蛋白。

主权项

一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法，其特征在于：通过重组杆状病毒Bm‑sp‑HA‑tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后，宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白；所述昆虫为家蚕蛹；所述重组杆状病毒Bm‑sp‑HA‑tm的构建方法包括以下步骤：(1)以gp64 DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽，所用引物：Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；Psp2：5’catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc 3’；(2)以gp64 DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域，所用引物：Ptm1：5’gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc 3’Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3’；(3)以禽流感病毒H5N1 HA基因为模板，PCR扩增HA基因，所用引物：Pha1：5’gaaaagaacgttactgttacacatgc 3’Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac 3’(4)以gp64信号肽和HA基因为模板，PCR扩增sp‑HA融合基因，所用引物：Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac 3’(5)以sp‑HA融合基因和gp64跨膜域为模板，PCR扩增sp‑HA‑tm融合基因，所用引物：Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3’；(6)将融合基因sp‑HA‑tm连接到pGEM‑T vector上，转化至感受态细胞E.coli DH5α中，构建得克隆质粒pGEM‑sp‑HA‑tm；(7)克隆质粒pGEM‑sp‑HA‑tm经BamH I和Not I双酶切切下sp‑HA‑tm融合基因片段克隆至经BamH I和Not I双酶切的pBacPAK8中，构建成重组转移质粒pBac‑sp‑HA‑tm；(8)取重组转移质粒pBac‑sp‑HA‑tm DNA和经Bsu36I酶切线性化的修饰型病毒BmBacPAK6 DNA，加入无血清的TC‑100培养基混匀，取Dosper加入无 血清的TC‑100培养基混均，将事先培养在平皿中的BmN细胞用无血清的TC‑100培养基洗涤两次，并逐滴加入pBac‑sp‑HA‑tm转移质粒和Dosper混合物，27℃培养4‑5天，取上清感染平皿中的BmN细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC‑100培养基和低熔点琼脂糖，4‑5天后挑取噬斑，感染BmN细胞3‑4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern blot斑点杂交，以sp‑HA‑tm融合基因作模板用随机引物探针标记试剂盒标记探针，杂交；取阳性克隆的上清感染家蚕细胞扩增，即得到含sp‑HA‑tm融合基因的重组杆状病毒Bm‑sp‑HA‑tm。