一种糜蛋白酶的纯化工艺

摘要

本发明涉及生物制药技术中糜蛋白酶领域一种糜蛋白酶的纯化工艺：碎浆；盐析，过滤；加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；过滤，用50kDa的超滤膜进行超滤；用5-10kDa的超滤膜进行超滤；滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；过滤，析晶；活化；沉淀；用10kDa的超滤膜进行超滤；SP离子交换柱纯化；用10-30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，即得。使用超滤膜与离子交换柱的结合来纯化糜蛋白酶，纯化效果好，得到的产品纯度高；本发明工艺得到的糜蛋白酶酶活性高，大于1500U/mg，可以减少用药量，减少患者医疗支出，也提高了该酶的用药安全性。

主权项

一种糜蛋白酶的纯化工艺，其特征在于包括以下步骤：（1）取牛胰，将脂肪、结缔组织除去，绞碎成胰浆；（2）向胰浆中加入硫酸溶液进行盐析，过滤；（3）滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；（4）过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤；（5）滤出液用截留分子量5‑10kDa的超滤膜进行超滤；（6）滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；（7）过滤，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3‑5倍，加硫酸调pH为2.0，搅拌使溶解，加入饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的2倍，调pH至5.0，25℃，孵育2‑5 h，有晶体析出，过滤收集晶体；（8）晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3‑5倍，调节pH 7.6，加入胰蛋白酶，20℃活化2‑4 h ；（9）调节pH 至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集沉淀；（10）沉淀用冷纯化水加硫酸溶解，用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤；（11）将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC 缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2 mol/L NaCl 的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4 mol/L NaCl 的缓冲液洗脱得洗脱液；（12）将上述洗脱液用截留分子量10‑30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，既得。