基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色进行三维重建方法

摘要

本发明公开了一种基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色进行三维重建方法。通过选择人胚胎新鲜标本，特别是非疾病死亡的引产胎儿，20周以上的胎龄人胚胎新鲜标本的三叉神经节，根及神经分支，经HE常规染色，利用光境、透射电镜观察，采用计算机TRI for win 95/NT，Version：3.01实现三维重建。本发明通过对人胚胎三叉神经的形态及运动根的走行进行研究，是人类历史上第一次将人胚胎三叉神经的三维立体结构展现出来，既丰富了人类三叉神经形态学研究的内容，同时为临床三叉神经痛的病理生理及治疗提供形态学依据，具有广泛的应用领域。

主权项

一种基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色进行三维重建方法，通过对标本的三叉神经根、节及分支染色，利用光镜、电镜观察，三维重建，其特征在于，按照体积百分比计，所述的基于人胚胎三叉神经利用组织切片染色进行三维重建具体步骤如下：(1)标本固定：在获取标本后1‑4h内，先用生理盐水心脏冲洗后，再以10％福尔马林溶液1000‑1500mL经主动脉灌注固定，干燥处避光保存；(2)肉眼观察：待标本完全固定后，取胎头，打开颅盖骨，暴露端脑，摘取一侧大脑半球及间脑，在外科显微镜下去掉部分中脑，确定左侧三叉神经根、节及三大分支进行巨细解剖与观察，进行实物拍照；(3)电镜观察：将获得的标本在外科显微镜下完整取出右侧三叉神经根、三叉神经节及三大分支，修整组织后，肉眼能区分三叉神经运动根，剥离三叉神经运动根；将取好的组织分别标记好置于装有2.5％戊二醛溶液的容器中，固定时间为72小时；将固定标记好的组织取出，移入1/15M磷酸缓冲液在PH7.4中漂洗3次，每次各15分钟；将漂洗后组织入1％饿酸固定液中后固定1小时后，按如上步骤漂洗后进入脱水；在进入50％酒精、70％酒精、80％酒精、90％酒精、100％酒精各脱水15分钟后，置于100％酒精中脱水；以v/v计，采用丙酮和环氧树脂按照1∶1液中浸透1小时，丙酮和环氧树脂1∶3液中浸透3小时，纯环氧树脂中浸透12小时后；采用纯环氧树脂包埋，37℃12小时，45℃12小时，60℃24小时；采用超薄切片机切片，选其中1‑2张切片，甲苯胺蓝染色后在光学显微镜下观察，根据甲苯胺蓝染色结果提供的依据，选择神经元较多的部位再进行超薄切片；选用醋酸双氧铀及柠檬酸铅双染色方法对切片进行染色；将切片 置于透射电镜观察，采集图片；(4)HE染色：将每个标本均以滤纸包裹，外以细纱布包裹水中浸泡12小时后，入75％酒精脱水4小时，85％酒精脱水4小时，90％酒精过夜，后置于95％酒精脱水4小时，100％酒精脱水4小时后再用100％酒精过夜；入二甲苯Ⅰ之中30分钟，入二甲苯Ⅱ中至透明为止；入电烤炉液体蜡Ⅰ中透蜡1小时，液体蜡Ⅱ中透蜡30分钟；取出标本放入包埋框中蜡油待其固定后放入自来水中冷却，待蜡块成形后，将蜡块修好标记，置于冰箱中冷藏，切片时使用；选用切片机，按冠状切面作连续切片，切片厚度为6μm；将裱好的切片置于染色架上，放入60℃烤箱中30分钟；取出后入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ液中各2分钟，入100％酒精Ⅰ、酒精Ⅱ、95％酒精、85％酒精各1‑2分钟，分别用自来水、蒸馏水冲洗片刻；苏木素浸染5分钟，自来水冲洗片刻入1％盐酸酒精分化3‑5秒，自来水冲洗片刻；氨水片刻，自来水冲洗片刻，入0.5％伊红溶液浸染5分钟，水洗片刻后入75％酒精、85％酒精、95％酒精Ⅰ、95％酒精Ⅱ、100％酒精Ⅰ、100％酒精Ⅱ各1‑2分钟脱水，再入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明各1‑2分钟；中性树胶封固切片标本，再将每张切片标记排序；将切片置于光镜下观察，采集图片；(5)三维重建：利用HE染色结果，在光镜下于40倍视野采集图像，用自动成像技术组成每张切片的整体原图；采用Adobe photoshop工具给每一张切片的细胞、神经根、各分支及运动根用不同的颜色画出边界线；将采用Adobe photoshop工具画好的每一张切片按从下往上的顺序排序，将每一张切片按照细胞、三大分支、运动根的位置对好，然后在组织旁边画一个三角，这个三角从第一张到最后一张切片的位置必须一致，它作为一个标准轴，用psd形式保存；将psd形式保存的每一张图像大小2446×2669，像素72，536KB，改为562×629， 像素100，52.2KB，修改后的图像用jpg形式保存；将jpg形式保存的每张图像按顺序输入计算机，选择重建的切片厚度。