一种基因消除PCR的方法

摘要

本发明公开了一种基因消除PCR的方法，本项发明可以消除混合基因群体中的非目标基因。本项发明的技术要点是把非目标基因做成或人工合成短序列基因消除引物，把含目标基因的混合基因群体酶切加上带有一个碱基误配的限制性酶切位点及带有Poly(dA)的接头，经过纯化作为模板，在PCR反应中，通过基因消除引物与模板退火延伸恢复正确的酶切位点，然后用耐热的限制性酶酶切从而消除非目标基因的接头，使其无法得到扩增。以上反应是利用PCR仪做如下循环：94℃，30秒；60℃，40秒；75℃，8分钟，经过12至18个循环，富集目标基因，然后常规PCR进一步扩增目标基因。本发明高效快速，操作简便，成本低廉，可重复性高，分离效果好且假阳性率低。

主权项

一种基因消除PCR的方法，其步骤是：(1)基因消除PCR模板的制备：a.限制性核酸内切酶ApeK‑I和Mse‑I消化含目标基因的混合基因群体；b.设计并合成四条寡核苷酸链O1，O2，O3，O4并制备接头，与上述(1)中a步骤的限制性酶切片段连接；c.Oligo‑dT柱子纯化上述(1)中b步骤加上接头的片段作基因消除PCR模板；(2)基因消除PCR引物的制备：a.限制性核酸内切酶ApeK‑I和Mse‑I消化不含目标基因的混合基因群体；b.设计并合成四条寡核苷酸链O5，O6，O7，O8并制备接头，与上述(2)中a步骤的限制性酶切片段连接；c.根据限制性内切酶位点与接头序列设计引物O5和O7对上述(2)中b步骤加上接头的片段进行PCR扩增；d.采用乙醇沉淀法对(2)中c步骤PCR产物进行纯化；e.限制性核酸内切酶Mse‑I消化(2)中d步骤纯化的PCR产物；f.PCR产物清洁试剂盒纯化上述(2)中e步骤酶切产物作基因消除PCR引物；(3)基因消除PCR循环：a.消除非目标基因，富集目标基因，条件为：在94℃条件下预热1分钟30秒；12至15个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，60℃退火40秒，75℃延伸8分钟，20ul反应体系为：40ng基因消除PCR模板，45ng基因消除PCR引物，6pM PCR引物O1，4mM dNTP，4ul 5×Phusion HF Buffer，4U ApeK‑I，0.35UPhusion DNA Ploymerase；b.目标基因的进一步扩增，条件为：在94℃条件下预热1分钟30秒；25至30个循环，每个循环包括：94℃变性30秒，54℃退火40秒，72℃延伸2分钟30秒，20ul反应体系为：4ul目标基因富集PCR产物，2ul 10×PCR Buffer，4mM dNTP，8pM PCR引物O1，8pM PCR引物O3，0.5U TaKaRa Taq，经过循环之后目标基因在琼脂糖凝胶上检测出来。